Идентификация MyoD интерактомные Использование Тандем Аффинная очистка В сочетании с масс-спектрометрии

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы исчерпывающе охарактеризовать партнеров по белку MyoD. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области биологии скелетных мышц, такие как молекулярная регуляция тональной деформации скелетных мышц ключевым фактором транскрипции мышц, MyoD. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет нам разгадывать партнеров MyoD, которые имеют выборочно низкую распространенность, локализованную в одном конкретном субядерном отсеке.

Хотя этот метод может дать представление о регуляции мышечной дифференцировки, он также может быть применен к другим системам, таким как любые другие ткани, в частности, к ядерной дифференцировке. Демонстрировать процедуру будет доктор Лауриан Фрич, научный сотрудник нашей лаборатории. В этом протоколе комплексы MyoD будут очищаться из клеток HeLa S3, которые стабильно экспрессируют MyoD с помощью меток глютенина FLAG.

В качестве контроля будут использоваться клетки HeLa S3, трансдуцированные с пустым вектором. Обе клеточные линии были ранее выращены, собраны и сохранены при температуре минус 80 градусов Цельсия, как описано в тексте протокола. Быстро разморозьте клеточные гранулы на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

Все буферы и гомогенизаторы должны быть предварительно охлаждены, и вся эта процедура должна выполняться в холодном помещении. Как правило, на каждую экспериментальную точку используется 20 граммов клеток, но для целей этой демонстрации будет обработано только 10 граммов, или около 10 мл клеток. Ресуспендируйте клетки в 10 мл гипотонического буфера А, используя сначала 5 мл буфера.

Затем, добавляя 2,5 мл, далее еще 2,5 мл. Хорошо промойте пипетку свежим буфером, чтобы получить максимум ячеек. Перелейте 20 мл клеточной суспензии в предварительно охлажденный гомогенизатор с помощью плотно прилегающего пестика.

Гомогенизируйте клетки с помощью 20 ударов. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 миллилитров. Для максимального восстановления клеток промойте гомогенизатор 3,5 мл сахарозного буфера.

Быстро перенесите эту суспензию в пробирку объемом 50 мл, чтобы сохранить ядра и ограничить утечку. Окрасьте 30 микролитров клеточной суспензии 30 микролитрами 4%-ного трипанового синего и проанализируйте под микроскопом для определения эффективности лизиса. Все ядра должны быть синего цвета, если лизис прошел успешно.

При необходимости повторите гомогенизацию. Центрифугируйте в течение семи минут при температуре 10 000 x g и четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать ядра. Сохраните надосадочную жидкость в виде цитоплазматической фракции.

Начните процедуру приготовления экстрагируемой ядерной соли с ресуспендирования гранул ядер в 4 мл сахарозного буфера. Затем добавьте 4 мл буфера с высоким содержанием соли по каплям, тщательно перемешивая на вихре, чтобы получить конечную концентрацию 300 мМ хлорида натрия. Выдерживать 30 минут на льду с перемешиванием каждые пять минут.

Затем уменьшите концентрацию хлорида натрия до 150 мМ, добавив 8 мл сахарозного буфера. Центрифугируйте в течение 10 минут при температуре 13 000 x g и четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость, которая представляет собой экстрагируемую соль фракцию, и оставьте ее на льду.

Чтобы приготовить связанную с хроматином фракцию, тщательно суспендируйте гранулу в 3,5 мл сахарозного буфера. Добавьте хлорид кальция до конечной концентрации 1 мМ и перемешайте. Хлорид кальция активирует микрококковую нуклеазу, которая будет добавлена позже.

Разогрейте суспензию в течение одной минуты при 37 градусах Цельсия. Добавьте 35 микролитров из 5 единиц на микролитр микрококковой нуклеазы, чтобы получить конечную концентрацию 25 10-тысячных единиц на микролитр. Выдерживайте ровно 12 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Перемешивайте каждые четыре минуты. Через 12 минут сразу же поместите реакцию на лед. Чтобы остановить активность микрококковой нуклеазы, добавьте 56 микролитров 5 моляров ЭДТА pH 8,0 до конечной концентрации 4 мМ и вортекс.

Инкубируйте в течение пяти минут на льду. Обрабатывайте ультразвуком пять раз в течение одной минуты каждый раз с высокой амплитудой, делая перерыв в одну минуту между ультразвуковыми исследованиями. Альтер-центрифуга извергает как экстрагируемую соль, так и обогащенную нуклеосомами фракции в течение 30 минут при 85 000 x g при четырех градусах Цельсия.

Соберите надосадочную жидкость. Экстрагируемая соль фракция должна составлять около 13 мл. А фракция, обогащенная нуклеосомами, должна составлять около 6 мл.

Белковые комплексы MyoD будут очищаться путем двойной аффинной очистки. Поскольку процедуры очистки на основе FLAG и HA схожи, будет продемонстрирована только очистка на основе FLAG. После добавления TEGN переведите соответствующий объем смолы FLAG в пробирку объемом 50 мл.

На каждую экспериментальную точку необходимо 300 микролитров смолы FLAG из коммерческой 50% стоковой смолы предварительной промывки FLAG. Центрифугируйте в течение двух минут при 1 000 x g. Удалите надосадочную жидкость, добавьте холодный ТЭГН и снова центрифугируйте.

Промойте смолу FLAG холодным TEGN в общей сложности пять раз. После последней промывки повторно суспендируйте смолу FLAG в равном объеме TEGN. Для каждой экспериментальной точки смешайте 300 микролитров промытой смолы FLAG и соответствующий белковый экстракт.

Используйте пробирку объемом 15 мл для фракции, обогащенной нуклеосомами, и пробирку объемом 50 мл для фракции, извлекаемой солью. Инкубируйте трубки на вращающемся колесе в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день центрифугируйте все пробирки в течение двух минут при температуре 1000 x g при четырех градусах Цельсия.

Соберите надосадочную жидкость и держите при температуре четыре градуса Цельсия до получения результата теста на эффективность очистки. Для образцов, извлекаемых из соли, повторно суспендируйте смолу FLAG в 4 мл TEGN и переложите в пробирку объемом 15 мл. Повторите этот шаг три раза, каждый раз переходя на одни и те же 15 мл, чтобы избежать потери бусин.

Центрифугируйте в течение двух минут при температуре 1000 x g при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости добавьте 13 мл TEGN в смолу FLAG и центрифугируйте в течение двух минут при температуре 1000 x g при четырех градусах Цельсия. Промойте смолу семь раз таким образом.

После последней промывки повторно суспендируйте смолу в 1 мл TEGN и переложите в пробирку с низким связыванием объемом 1,5 мл. Центрифугируйте в течение двух минут и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендировать смолу для каждой опытной точки в 100 микролитрах раствора пептида FLAG в концентрации 4 мг/мл при pH 7,8 Хорошо перемешать и добавить 100 микролитров буфера TEGN.

Инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия не менее четырех часов, чтобы вымыть связанные белки. Центрифугируйте в течение двух минут и перенесите смолу и надосадочную жидкость в пустую спиновую колонку, помещенную в пробирку объемом 2 мл. Центрифугируйте колонку в течение одной минуты при 6 000 x g.

Соберите остатки надосадочной жидкости в пробирку объемом 2 мл. Затем проверяется эффективность очистки, как описано в тексте протокола, прежде чем приступать к очистке на основе ГК. Здесь представлены репрезентативные результаты двойных аффинных очищенных комплексов MyoD из экстрагируемых ядерной солью или обогащенных нуклеасом фракций клеточной линии HeLa S3, стабильно экспрессирующих FLAG HA MyoD.

Серебристое окрашивание идентифицировано FLAG HA MyoD обозначено стрелкой, которая отсутствует на линии имитации клетки. Очищенные комплексы MyoD с двойным сродством фракционировали по градиентам глицерина. Западный блоттинг фракций с использованием антител против FLAG выявил субкомплексы MyoD в двух субядерных компартментах.

В частности, экстрагируемый солью MyoD распределен в трех подкомплексах, в то время как связанный с хроматином MyoD принадлежит в основном к одному комплексу. Масс-спектрометрический анализ интеракторов MyoD, выделенных из фракций ядерной соли, экстрагируемых и обогащенных нуклеосомами, выявил ряд известных партнеров и новых партнеров MyoD. Здесь интеракторы MyoD, находящиеся в обеих дробях или, в частности, для одной из дробей, группируются на основе их функциональных аннотаций.

Некоторые из выявленных масс-спектрометрией интеракторов были подтверждены вестерн-блоттингом на комплексах MyoD. К ним относятся факторы транскрипции CBF, субъединица SWI/SNF белки BAF47 и HP1. Поскольку клетки HeLa не являются мышечными клетками и обычно не экспрессируют MyoD, необходимо подтвердить взаимодействие между вновь идентифицированными интеракторами и MyoD и миобластами.

Для иммунопреципитации и западного анализа с указанными антителами использовали ядерные суммарные экстракты из пролиферирующих и дифференцирующих мышиных миобластов. После освоения этой техники ее можно сделать за два с половиной дня, если она выполнена правильно. При проведении этой процедуры важно помнить о необходимости уточнения полученных результатов в миобластах.

Следуя этой процедуре, можно использовать другие методы, такие как нокдаун конкретного партнера в релевантной системе, такой как миобласты, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как функциональное значение взаимодействия. После своего развития этот метод прокладывает путь исследователям в области биологической эпигенетики развития к изучению сети регуляции пяти факторов транскрипции в большинстве систем организма. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как определить партнеров для транскрипционного фактора путем проведения фракционирования клеток с последующей тандемной аффинной очисткой в сочетании с масс-спектрометрией.