Ориентация биопленки Associated

Общая цель данной процедуры заключается в простом и воспроизводимом выращивании бактериальных биопленок в формате 96-луночного планшета на штифтах, прикрепленных к крышке, для тестирования чувствительности к антибиотикам с использованием красителя жизнеспособности. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области поиска и разработки антибиотиков путем изучения активности в отношении клеток, ассоциированных с биопленками, которые зачастую более точно представляют состояния инфекции in vivo. Основным преимуществом данной техники является возможность легко воздействовать на предварительно сформированные биопленки в трехэтапном анализе в среде и определять степень ингибирования с помощью стандартного красителя жизнеспособности.

Для начала вырастите культуру организма, образующего биопленку, в богатой питательной среде. Инокулируйте штамм Staphylococcus aureus Newman из глицериневого стока в 10 миллилитров среды Мюллера-Хинтона. Все работы, связанные с манипуляциями с S.aureus, следует проводить в перчатках и в шкафу биологической безопасности.

Инкубируйте в течение 16 часов при 37 °C на ротационном шейкере. Перенесите расчетный объем культуры в центрифужную пробирку и осадите клетки, центрифугируя в течение одной минуты при 10 000 Gs. Для подготовки инокулята биопленки аспирируйте отработанную ростовую среду и ресуспендируйте осадок клеток в 20 мл CRPMI. С помощью многоканального дозатора на 200 мкл добавьте по 125 мкл инокулята из резервуара объемом 25 мл в каждую лунку рядов с A по G нижнего планшета.

Залейте по 125 мкл стерильной среды CRPMI в каждую лунку ряда H в качестве контроля стерильности. Возьмите крышку с штифтами и удерживайте ее над дном планшета штифтами вниз. Осторожно совместите каждый штифт с соответствующей лункой.

Избегайте физического контакта между планшетом и штифтами. После выравнивания осторожно опустите крышку. Чтобы предотвратить испарение, загерметизируйте стык крышки и планшета парафиновой пленкой, затем поместите конструкцию в герметичный пластиковый пакет, плотно закрыв его.

Поддерживайте минимальный объем воздуха в пакете, чтобы свести к минимуму испарение. Инкубируйте планшет без встряхивания при 37 °C в течение 48 часов в инкубаторе с 5% Carbon Dioxide. В день проведения теста на биопленку возьмите новый 96-луночный планшет и добавьте по 100 µL CRPMI, доведенного до комнатной температуры, в каждую лунку рядов от B до H. Разведите до четырех исследуемых соединений по отдельности в 1,0 mL CRPMI до концентрации, в 2 раза превышающей желаемую конечную концентрацию.

Добавьте по 200 µL соединения 1 в лунки A1-A3, по 200 µL соединения 2 в лунки A4-A6, по 200 µL соединения 3 в лунки A7-A9 и по 200 µL соединения 4 в лунки A10-A12. Выполните серийное разведение исследуемых соединений с помощью многоканального дозатора.

Начните с переноса 100 мкл из ряда A в ряд B, затем перемешайте. Таким же образом продолжайте переносить по 100 мкл из лунки в лунку. Перемешивайте после каждого переноса и остановитесь на ряду F. После перемешивания удалите 100 мкл из ряда F в контейнер для отходов.

Не переносите жидкость в ряды G и H. Наконец, добавьте по 100 µL CRPMI в каждую лунку планшета с помощью многоканального дозатора, чтобы довести конечный объем до 200 µL. Добавьте по 200 µL фосфатно-солевого буферного раствора в новый стерильный 96-луночный планшет, размеры лунок которого идентичны размерам лунок планшета для инициирования биопленки. Затем снимите пластиковый пакет и парафиновую пленку с инкубируемого планшета для инициирования биопленки.

Поднимите крышку строго вертикально вверх, избегая контакта между штифтами и дном планшета, так как это может повредить биопленку. Сохраните нижнюю часть для последующего анализа OD600. Удалите планктонные клетки, поместив крышку со штифтами в планшет с PBS.

Погрузите штифты в раствор на пять секунд. Поднимите их из PBS и погрузите повторно, стараясь не задевать стенки лунок. Поместите промытую крышку со штифтами в планшет для тестирования.

Избегайте ненужного контакта между штифтами и дном планшета, так как это повредит биопленку, что приведет к противоречивым результатам. Герметизируйте планшет парафиновой пленкой и, как и ранее, поместите его в герметичный пластиковый пакет. Инкубируйте планшет без встряхивания в течение 24 часов при 37 °C в инкубаторе с 5% Carbon Dioxide.

Возьмите нижнюю часть планшета для инициации биопленки и ресуспендируйте бактерии в каждой лунке с помощью многоканального дозатора. Измерьте OD600 на подходящем ридере микропланшетов, чтобы подтвердить рост во всех лунках, за исключением стерильных контролей в ряду H. Используйте ридер планшетов, оснащенный инкубационной камерой и способный выполнять кинетические измерения флуоресценции для детектирования превращения резазурина. Настройте 24-часовое кинетическое измерение флуоресценции с возбуждением на 530 нанометрах и эмиссией на 590 нанометрах.

Установите температуру в камере на 37 °C и настройте считывание планшета каждые 20 минут. Настройте планшетный ридер на измерение с нижней стороны планшета в соответствии с инструкциями производителя. Подготовьте планшет к промывке, добавив многоканальным дозатором по 200 µL PBS в каждую лунку стерильного 96-луночного планшета.

Затем приготовьте среду для восстановления биопленки, добавив 400 µL исходного раствора резазурина с концентрацией 0,8 mg/mL к 20 mL среды CRPMI до конечной концентрации резазурина 16 µg/mL. Затем с помощью многоканального пипеточного дозатора внесите по 150 µL среды для восстановления биопленки в каждую лунку нового 96-луночного планшета. Переместите планшет с образцами из инкубатора в шкаф биологической безопасности и осторожно снимите пластиковый пакет и герметизирующую пленку.

Снимите крышку с колышками с планшета для испытания и, как и ранее, промойте планктонные клетки в PBS, сохранив нижнюю часть планшета для последующего анализа OD600. После промывки поместите крышку с колышками в нижнюю часть планшета, содержащую среду для восстановления биопленки. Оберните края планшета парафиновой пленкой, стараясь не перекрывать дно периферийных лунок.

Сразу после обертывания планшета поместите его в планшетный ридер и запустите кинетическое считывание в течение 24 часов, активировав ранее созданный протокол кинетики резазурина. Для количественного определения роста планктонных клеток, который может или не может произойти во время теста, измерьте OD600 всего дна планшета с использованием микропланшетного ридера. Здесь представлен пример схемы расположения образцов в планшете с использованием двух полных разведений для титрования концентраций соединения.

Выросшие биопленки обрабатывали неокупроином или его медным комплексом. Показатели OD600 дна контрольной планшетки через 24 часа показали, что медный комплекс неокупроина, но не сам неокупроин, предотвращал отделение и последующий рост жизнеспособных клеток из обработанных биопленок при концентрациях 1,25 micromolar и выше. Соответствующие биопленки затем тестировали с помощью резазуринового анализа.

Визуальный осмотр через 24 часа позволяет быстро получить утвердительный или отрицательный ответ при параллельном тестировании нескольких планшетов. Резазурин окрашивается в розовый цвет в лунках с жизнеспособными биопленками, но остается синим, если биопленка была уничтожена. Кинетическое считывание конверсии резазурина позволяет выявить эффекты, зависящие от концентрации, в отношении жизнеспособности биопленки, что продемонстрировано здесь на примере гентамицина.

Зависимая от концентрации задержка начала изменения цвета красителя свидетельствует о снижении жизнеспособности биопленки. При выполнении данной процедуры важно следить за тем, чтобы штифты не ударялись о стенки лунок.