Шаг за шагом для протокола субретинальной хирургии в Кролики

Общей целью этого хирургического вмешательства является замена дисфункционального пигментного эпителия сетчатки, или РПЭ, чтобы найти возможное лекарство от заболеваний, связанных с РПЭ, таких как возрастная макулярная дегенерация. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области оптометрии о клеточной терапии и возрастной макулярной дегенерации. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может обеспечить модальность транспортировки клеточного субстрата или устройств для доставки лекарств в субретинальное пространство.

Хотя этот метод может дать представление о витрэктомии и субретинальной хирургии у кроликов, он также может быть использован на других модельных организмах, таких как свиньи, обезьяны или люди. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, поскольку не только внутриглазная хирургия сложна, но и персонал, организация и технологии для этой процедуры должны быть хорошо синхронизированы. Демонстрировать процедуру нагрузки инструментами будут Фабиан Тильтгес, постдок, и Ральф Бринкен, хирургическая медсестра, оба из моей лаборатории.

Перед началом операции подтвердите соответствующий уровень анестезии и нанесите глазную мазь на другой неоперированный глаз животного. Затем поместите кролика под хирургический микроскоп на левый бок так, чтобы правый глаз был обращен вверх, а нос был слегка приподнят складкой одеяла. Продезинфицируйте глаз в течение одной минуты несколькими каплями повидон-йода.

Затем промойте глаз стерильным BSS, а голову животного накройте стерильной простыней с предварительно вырезанным отверстием для глаза. Поместите на глаз кусок липкой хирургической простыни для разреза размером 12 на 17 см и с помощью ножниц обнажите глаз с помощью горизонтального разреза по средней линии. С помощью перевернутых штангенциркулей сместите глаз в проптозанное положение и закрепите ткань шелковым швом 3-0

Затем с помощью ножниц Vannas разрежьте конъюнктиву рядом с лимбом, примерно в одном миллиметре от соседних кровеносных сосудов, и увеличьте перитомию параллельно лимбу. Тупо отделите конъюнктиву, а затем сделайте перпендикулярный вертикальный разрез от шести до семи миллиметров, чтобы сделать Т-образную форму в конъюнктиве. Сделайте еще одну небольшую перитомию в положении 2 часа.

Затем осторожно введите кончик микровитреоретинального лезвия 23-го калибра через склеру, направленную к заднему полюсу глаза на расстоянии 3,5 миллиметра от лимба в положении «8 часов». Чтобы избежать увеличения разреза, медленно втяните лезвие в том же направлении и предварительно наложите шов 7-0 Vicryl. Затем вставьте специальную боковую канюлю для инфузионной инфузии в склеральное отверстие и с помощью предварительно наложенного шва закрепите канюлю.

Установите внутриглазное давление на уровне от 20 до 24 миллиметров ртутного столба. Затем с помощью троакара с плоской головкой 25 калибра проткните склеру в положении «2 часа» и вставьте в порт люстру 25 калибра. Закрепите свет скотчем и отрегулируйте его примерно на 30% мощности, затем отрегулируйте по отдельности.

Используйте скальпель 20 для удаления отечного эпителия роговицы, чтобы облегчить лучшую внутриглазную визуализацию. Теперь проведите еще одну склеротомию с помощью микровитреоретинального лезвия 23-го калибра в положении «10 часов» и наложите U-образный шов 7-0 Vicryl вокруг надрезанной склеры, не завязывая полностью узел. Вставьте наконечник высокоскоростного витректора в разрез и начните витрэктомии вокруг входного порта.

Разрежьте стекловидное тело на мелкие кусочки с максимальной скоростью от 2 000 до 3 000 разрезов в минуту, продолжая витрэктомию над диском зрительного нерва и мозговыми волокнами и аспирируя при максимальной давлении 200 миллиметров ртутного столба. Чтобы аккуратно отделить стекловидное тело от сетчатки, держите витректор над задним полюсом и нижней частью диска и продолжайте аспирацию без разрезания. Когда задняя отслойка стекловидного тела завершена, интравитреально вводится около 50 микролитров исследуемого соединения, чтобы визуализировать плавающее стекловидное тело во время его почти полного удаления.

Когда глаз будет подготовлен, трижды промойте культуру имплантационных клеток недополненным офтальмологическим BSS. Затем наполните чашку для клеточных культур размером 100 на 20 миллиметров 10 миллилитрами офтальмологического BSS и добавьте в чашку вкладыш для клеточных культур. Центрируйте чашку под световым микроскопом и с помощью острой овальной полой иглы, изготовленной на заказ, выдавите плоскую бобовую подложку размером 2,4 на 1,1 миллиметра с двумя длинными краями и двумя круглыми краями из клеточной культуры.

Осторожно проведите иглу через второй порт с BSS, чтобы промыть имплантат в чашку для клеточной культуры, заполненную BSS. Чтобы получить третий край, сделайте разрез объемом 0,5 миллилитра на одном из круглых концов имплантата и с помощью мембранно-отшелушивающих щипцов 23-го калибра перенесите имплантат в специально изготовленную станцию нагрузки. Убедитесь, что имплантат находится в вертикальном положении, затем с помощью щипцов аккуратно введите имплантат полностью в стрелочный инструмент, пока вся ткань не будет закреплена внутри наконечника, и поместите наконечник стрелка в загрузочную станцию под BSS, пока клетки не будут имплантированы.

Чтобы обеспечить имплантацию клеток под сетчаткой, подойдите к нервной сетчатке с помощью выдвижной субретинальной инъекционной иглы 41-го калибра, подключенной к газонепроницаемому шприцу, и субретинально введите BSS для создания отслойки сетчатки с пузырьком. Когда диаметр шарика составляет от 2 до 3 дисков, используйте вертикальные VR-ножницы 23-го калибра, чтобы увеличить ретинотомию до 1,5 миллиметров, и используйте нож для разреза 1,4 миллиметра, чтобы точно продлить 10-часовую склеротомию до 20-го калибра. Затем попытайтесь пропустить манекен стрелка 20-го калибра через склеротомию, увеличивая разрез по мере необходимости, чтобы обеспечить плавный, но плотный переход заряженного стрелка.

Затем пропустите заряженный стрелок через склеральный разрез с температурой от 20 до 24 миллиметров ртутного столба до края ретинотомии и введите имплантат субретинально из эпиретинального положения. Стрелок должен быстро проходить через склеру с первой попытки, поэтому обеспечьте склеротомию оптимального размера. Затем клетки РПЭ должны быть имплантированы субретинально под небольшим углом, чтобы избежать ущемления переднего края имплантата в мембране Бруха.

Отрегулируйте имплантат таким образом, чтобы он был размещен под сетчаткой в достаточном отдалении от ретинотомии. Затем извлеките порт из склеротомии и введите 25 микролитров триамцинолона через порт люстры. С помощью швов 7-0 закройте 2 и 10 часовые склеротомии и проверьте на герметичность.

Снимите канюлю для инфузии и немедленно закройте последнюю склеротомию заранее наложенным швом 7-0 Викрилом. С помощью иглы 30 калибра введите BSS для регулировки внутриглазного давления по мере необходимости, одновременно пальпируя. Наконец, зашите конъюнктиву 7-0 Викрилом и удалите проптозирующий шелк, стараясь не затрагивать глубокие орбитальные венозные сплетения.

Хирургическая успешность приживления под сетчаткой составляет примерно 60% при проведении витрэктомии кора, которая увеличивается до более чем 75% при индуцировании задней отслойки стекловидного тела. Здесь показано изображение инфракрасного отражения ксенотрансплантированного пигментного эпителия сетчатки на полиэфирной мембране после несложной процедуры, при этом атрофия фоторецептора в результате иммунной реакции проявляется в виде ореола вокруг имплантата. На этом соответствующем изображении оптической когерентной томографии в спектральной области можно наблюдать истончение внешнего ядерного слоя в ответ на ксенотрансплантацию РПЭ, в основном в сетчатке с видимой гиперрефлективной полосой над имплантатом.

Однако нервная сетчатка, прилегающая к имплантату, демонстрирует почти нормальные полосы отражения, что указывает на атравматическую доставку имплантата. Как видно при окрашивании H/E, субретинальное рубцевание и атрофия наружного ядерного слоя возникают у ксенотрансплантированных кроликов без иммуносупрессии. Мембрана Бруха под имплантатом также, по-видимому, прилегает, а хориокапилляры содержат несколько разбросанных эритроцитов, что еще раз подтверждает отсутствие травмы, полученной во время имплантации.

После освоения этой техники ее можно выполнить за один час, если не возникнет никаких осложнений. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о создании пузыря сетчатки и ретинотомии ровно настолько, чтобы он соответствовал имплантату. Кроме того, более быстрое хирургическое вмешательство, как правило, дает лучшие результаты.

После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как оптическая когерентная томография или гистология, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как успех трансплантации, субретинальная биосовместимость и выживаемость трансплантированных клеток. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии стволовых клеток и биоматериалов для изучения субретинальной доставки производных стволовых клеток и/или биофункционализированных субстратов-носителей для заболеваний сетчатки, в частности РПЭ. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить витрэктомию и операцию субретинальной имплантации у кроликов.

Не забывайте, что работа с хрусталиком, витреоретинальным и субретинальным интерфейсом может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как правильное положение рук, хорошая визуализация, стабильное внутриглазное давление.