Визуализация сосудистой и паренхиматозных регенерации после того, как 70% частичной гепатэктомии у нормальных мышей

Визуализация регенерации сосудов и паренхимы после 70% частичной гепатэктомии у здоровых мышей. Традиционно регенерация печени оценивается путем измерения увеличения массы и объема печени, а также путем определения скорости пролиферации гепатоцитов. В настоящее время мы заинтересованы в регенерации сосудистой печени у мышей и хотим визуализировать и количественно оценить рост сосудов.

Таким образом, мы устанавливаем рабочий процесс визуализации сосудистой регенерации. Рабочий процесс состоит из четырех этапов: контрастирование сосудистого дерева, получение снимков компьютерной томографии, 3D-реконструкция, а также количественный и качественный анализ полученных изображений. Рабочий процесс начинается с контрастирования сосудистого дерева.

Сначала мы обнажаем печень, нормальную или резецированную, затем вводим полимеризующееся силиконовое контрастное вещество в воротную вену или печеночную вену, в зависимости от интересующей сосудистой системы. Далее эксплантированная печень подвергается сканированию на микрокомпьютерной томографии. После сканирования мы выполняем 3D-реконструкцию сосудов с помощью доклинического программного обеспечения Imalytics.

Если техническое качество получаемых изображений достаточно хорошее, 3D-реконструкция может быть выполнена с помощью HepaVision. Эта программа используется в клиниках для планирования гепатобилиарной хирургии. В дополнение к 3D-визуализации сосудистого дерева, эта программа позволяет визуализировать и рассчитать объем печени, всей печени и каждой доли, исходя из питающих и дренирующих сосудов.

После реконструкции мы можем определить дополнительные параметры, указывающие на рост сосудов, такие как длина и диаметр конкретного сосуда, с помощью вычислительных методов. Это позволит количественно описать рост сосудов. С другой стороны, образцы Microfil с фиксированным формалином могут быть разрезаны на серийные срезы.

Серийные срезы могут быть окрашены и оцифрованы с помощью сканера всего предметного стекла. После жесткой и эластической регистрации серийных срезов можно реконструировать 3D-сосудистые деревья как портной, так и печеночной венозной систем. На следующем этапе мы хотим исследовать пространственное распределение молекулярных событий.

Одним из примеров молекулярного события, представляющего интерес для регенерации печени, является появление маркера пролиферации Ki-67 в ядрах гепатоцитов и его пространственное распределение в 3D-реконструированных сосудистых деревьях. Далее мы подробно расскажем о том, как выполнять инъекцию Microfil. Подготовка реактивов.

Для смеси микрофила нам понадобится разбавитель МВ, МВ компаунд, в нашем случае синий МВ-120 и отвердитель. Нам также понадобятся пипетки, трубка и пипеттор. Приготовьте два миллилитра МВ-120 в одной пятимиллилитровой тубе.

Затем разбавьте его, добавив три миллилитра разбавителя MV. Перемешайте их, слегка встряхивая. Для получения солевого раствора гепарина добавьте 1 миллилитр гепарина в 10 миллилитр физиологического раствора.

Подготовка операционного стола. Во-первых, нужен микроскоп, во-вторых, нужен набор расходных материалов. Шелковые шовные нити 6-0 и полипропиленовые шовные материалы 6-0, шприцы на пять миллилитров и один миллилитр, иглы 30 калибра и 21 калибра, удлинительная трубка для соединения шприца и катетера, катетер 26 калибра с вводом иглы, ватные наконечники и марля.

В-третьих, необходимы хирургические инструменты. Микроинструменты, зажимы и электрический коагулятор. В-четвертых, необходим перфузионный насос.

Подготовка животного. Поместите мышь в индукционную камеру для анестезии и обезболите мышь 2% изофлураном и 0,3 миллилитром кислорода в минуту. Зафиксировать обезболенную мышь на операционном столе с помощью пластырей, с непрерывной ингаляцией 2%-ного изофлурана и 0,3 миллилитра кислорода в минуту.

Инъекция микрофила, портальная венозная система. Сделайте поперечный разрез на животе с помощью ножниц для слоя кожи и электрического коагулятора для мышечного слоя. Выведите кишки в левую сторону с помощью ватных наконечников и накройте кишки марлей, пропитанной солевым раствором.

Рассеките воротную вену под микроскопом. Поместите шелковый шов 6-0 под внепеченочную воротную вену на расстоянии примерно одного миллиметра до ее раздвоения. Свободно завяжите его для последующего использования.

Введите раствор гепарина физиологического раствора через вену полового члена для системной гепаринизации в течение пяти минут. В этой анимации будет показана процедура введения катетера. Сначала поместите шелковый шов 6-0 под внепеченочную воротную вену, затем вставьте катетер 26 калибра в воротную вену и зафиксируйте его с помощью зажима.

Перевязать заранее наложенный шов для фиксации катетера и блокирования кровотока из селезеночной вены и брыжеечной вены. Здесь мы продемонстрируем хирургическую процедуру. Введите катетер 26 калибра с иглой.

Введите катетер дальше и одновременно медленно выдвигайте иглу. Зафиксируйте катетер с помощью зажима. Полностью заполните катетер физиологическим раствором гепарина, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.

Подсоедините удлинительную трубку к катетеру и плотно зафиксируйте их. Включите перфузионный насос. Начните перфузию гепарином физиологического раствора со скоростью потока 0,4 миллилитра в минуту.

Наблюдайте, как правые доли становятся бледными сразу после перфузии. Промойте печень солевым раствором, чтобы сохранить ее влажной в течение всей процедуры перфузии. Усыпите мышь путем обескровливания с помощью перфузии под анестезией.

Продолжайте перфузию гепарина в течение нескольких минут, пока вся печень не станет бледной. Перед перфузией Microfil добавьте 0,1 миллилитра отвердителя в приготовленный состав Microfil для ускорения процедуры полимеризации. Загрузите состав Microfil в пятимиллилитровый шприц и удлинительную трубку.

Избавьтесь от пузырьков воздуха, введя в катетер раствор гепарина физиологического раствора, как и раньше. Соедините трубку с катетером и плотно зафиксируйте ее. Начните инъекцию Microfil со скоростью потока 0,2 миллилитра в минуту в течение примерно одной-двух минут.

Наблюдайте, как синее вещество медленно распространяется по ветвям воротной жилки. Остановите перфузию, когда на поверхности каждой доли печени появится синяя структура сосуда, как показано красным кругом. Оставьте печень не менее чем на 15 минут для полимеризации соединения Microfil.

Инъекция микрофила, печеночная венозная система. Процедура в основном состоит из тех же этапов, что и инъекция в воротную венозную систему. Наложите шелковый шов 6-0 под внепеченочную воротную вену на расстоянии примерно одного миллиметра до ее раздвоения.

Затем вставьте катетер в воротную вену и зафиксируйте его с помощью зажима. Вставьте еще один катетер в нижнюю полую вену и также зафиксируйте его зажимом. Перевязать заранее наложенный шов для фиксации катетера и блокирования кровотока из селезеночной вены и брыжеечной вены.

Наложите зажим на надпеченочную нижнюю полую вену, чтобы затруднить отток печени. Лигатные ветви нижней полой вены, включая обе почечные вены и дистальный конец нижней полой вены. Промойте печень солевым раствором гепарина через катетер.

Перфузируйте печеночную венозную систему составом Microfil через второй катетер. Результаты, Микрокомпьютерная томография реконструкции. Мы получили 3D-реконструкции сосудов с помощью доклинического программного обеспечения Imalytics после микрокомпьютерной томографии.

Регенерация сосудов как в портной, так и в печеночной венозной системах проявлялась в удлинении и расширении основных сосудистых структур в сочетании с разветвлением более мелких сосудов. На вторые сутки после операции сосудистые деревья остаточных долей удлинились. К седьмому дню после операции стали видны дополнительные небольшие ответвления от той же главной воротной вены и печеночной вены.

Результаты, 3D цветовая реконструкция сосудистого дерева печени и зависимых от него печеночных территорий. Каждая доля печени была легко визуализирована во всех трех измерениях после реконструкции с цветовой кодировкой с помощью HepaVision. Как указано в таблице, печеночные объемы всей печени и каждой доли определяли, как показано здесь, для печеночной венозной системы нормальной печени.

Результаты, серийные разрезы и реконструкция. С другой стороны, фиксированный формалином образец Microfil подвергали серийному срезу. Окрашенные серийные срезы были оцифрованы с помощью сканера цельного стекла и использованы для реконструкции сосудистого дерева обеих систем.

Это поперечные сечения стека последовательных срезов печени мыши до и после жесткой и упругой регистрации. После компьютерной регистрации портальные венозные и печеночные венозные системы могут быть реконструированы в одной 3D-модели. Этот трудоемкий с точки зрения ручных и вычислительных ресурсов шаг требует дальнейшей оптимизации.

Следующий шаг, а именно визуализация пространственного распределения молекулярных событий относительно сосудистых деревьев, в настоящее время находится в разработке. Этот этап можно рассматривать как слияние информации микрокомпьютерной томографии, полученной из контрастного сосудистого дерева, с гистологической информацией или как 3D-визуализацию чисто гистологической информации. В этом случае информация микрокомпьютерной томографии будет служить контролем качества для сложной 3D-реконструкции, основанной на гистологии.

Как только это будет достигнуто, у нас будет инструмент для лучшего исследования регенерации печени. Особенно пространственное распределение молекулярных событий и печеночная паренхима в отношении регенерации сосудов.