Мышиные Hind Лимб длинных трубчатых костей Вскрытие и костного мозга Изоляция

Общая цель данной процедуры препарирования длинных костей и выделения костного мозга заключается в быстром и систематическом удалении длинных костей и сборе костного мозга для последующего анализа. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы, касающиеся биологии костного мозга, метастазирования рака и иммунологии. Основным преимуществом данной методики является то, что процесс препарирования проходит быстро и стандартизировано, а процедура выделения костного мозга является достаточно стерильной. Начните с размещения мыши в положении на спине.

Затем закрепите все четыре подушечки лап ниже голеностопного сустава и опрыскайте мышь 70% ethanol, тщательно смочив конечности. Далее сделайте небольшой разрез справа от средней линии в нижней части живота чуть выше бедра и продлите разрез вниз по ноге за пределы голеностопного сустава. Оттяните кожу.

Затем рассеките четырехглавую мышцу, прикрепленную к проксимальному концу бедренной кости, чтобы обнажить переднюю поверхность бедра, и закрепите мышцу булавкой, отведя ее в сторону от ноги под углом 45 градусов относительно доски. Приложив ножницы к задней поверхности бедренной кости, отсеките мышцы задней группы бедра от коленного сустава. Затем оттяните кожу и мышцы задней группы бедра, прикрепленные к проксимальному концу бедренной кости, чтобы обнажить заднюю поверхность кости, и закрепите эти мышцы булавкой, устанавливая ее под углом 45 градусов.

С помощью пинцета захватите дистальный конец бедренной кости чуть выше коленного сустава. Затем направьте лезвия ножниц по обе стороны от диафиза бедренной кости в сторону тазобедренного сустава. Дойдя до головки бедренной кости, поверните ножницы, переместив верхнее лезвие непосредственно над головкой бедра, чтобы вывихнуть бедренную кость.

Теперь захватите верхушку диафиза бедренной кости пинцетом и отсеките мягкие ткани от головки бедренной кости, чтобы освободить бедренную кость из вертлужной впадины. Затем потяните всю кость ноги, включая бедренную кость, колено и большеберцовую кость, вверх и в сторону от тела и осторожно отсеките соединительную ткань и мышцы, прикрепляющие ногу к коже. Когда вся соединительная ткань будет удалена, максимально разгибайте голеностопный сустав и поверните ножницы, как было только что продемонстрировано, чтобы вывихнуть большеберцовую кость.

Захватите дистальный конец большеберцовой кости, стараясь не перерезать сухожилия, и потяните кость вверх, удаляя ее от тела и фиксирующей доски. Затем удалите все оставшиеся соединительные ткани, прикрепленные к длинной кости в области колена, а также любые дополнительные мышцы или соединительную ткань, прикрепленные к бедренной и большеберцовой костям. Чтобы подготовить длинную кость к выделению костного мозга, захватите бедренную кость так, чтобы надколенник был обращен в противоположную сторону, а головка бедренной кости была направлена вниз.

Переразгибайте коленный сустав и поверните ножницы, чтобы вывихнуть большеберцовую кость из бедренной. Затем удалите любые соединительные ткани, удерживающие бедренную и большеберцовую кости вместе. После этого захватите бедренную кость так, чтобы передняя сторона была обращена от вас, а головка бедренной кости была направлена вниз, и ведите ножницами вверх по диафизу бедренной кости к мыщелкам.

Осторожно перемещайте ножницы вперед и назад, чтобы удалить мыщелки, надколенник и эпифиз, обнажив метафиз. Затем с помощью пинцета, ножниц и салфеток Kimwipes удалите все остатки мышечной или соединительной ткани, прикрепленной к бедренной кости. После этого захватите большеберцовую кость так, чтобы передняя сторона была обращена от вас, а конец в области голеностопа был направлен вниз.

Если эпифиз большеберцовой кости цел, проведите ножницами вдоль диафиза большеберцовой кости к мыщелкам и аккуратно поворачивайте ножницы вперед и назад, чтобы удалить мыщелки и эпифиз, обнажив метафиз большеберцовой кости. Затем удалите все дополнительные мышечные или соединительные ткани, прикрепленные к большеберцовой кости, как было только что продемонстрировано. Чтобы забрать костный мозг, сначала проденьте иглу 18 gauge через дно микроцентрифужной пробирки объемом 0.5 milliliter.

Затем поместите длинные кости в пробирку коленным суставом вниз и закройте крышку. Поместите микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте пробирки в микроцентрифуге при ускорении ≥ 10 000 ×g в течение 15 секунд. Визуально убедитесь, что костный мозг был выцентрифугирован из костей.

Кости должны иметь белый цвет, а в более крупной пробирке должен быть виден крупный осадок. Затем удалите кости из микроцентрифужной пробирки объемом 0.5 milliliter и суспендируйте костный мозг в соответствующем растворе для последующего анализа. Данный метод экспресс-диссекции подходит для ряда последующих анализов, включая гистоморфометрию и гистологию.

Как показано на данной репрезентативной гистоморфометрической 3D-реконструкции методом микро-КТ, сохраняются как трабекулярная кость, так и кортикальный слой, что позволяет точно определить стандартные структурные параметры для гистоморфометрии кости. На данном репрезентативном гистологическом срезе фиксированной формалином, декальцинированной и окрашенной гематоксилином и эозином (H and E) большеберцовой кости можно наблюдать сохранение целостности как обызвествленной костной ткани, так и клеточного костного мозга для гистологического анализа. Кроме того, костный мозг, выделенный данным методом, подходит для многих последующих применений, включая первичный клеточный культивирование остеокластов или остеобластов.

После освоения техники, при ее правильном выполнении, процедура — от препарирования длинных костей до выделения костного мозга — занимает около семи минут. При выполнении процедуры важно правильно расположить мышь для облегчения диссекции. После завершения данной процедуры можно использовать другие методы, такие как FACS или другие методы анализа единичных клеток, для получения дополнительных ответов на вопросы об изменениях в популяциях клеток костного мозга.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как быстро препарировать длинные кости мышей и выделять костный мозг методом центрифугирования.