Эффективное нуклеиновые кислоты Добыча и 16S рРНК генов Секвенирование для Бактериальные сообщества Характеристика

Общая цель этой процедуры заключается в выделении высококачественных ДНК и РНК из мазков, а затем определении их бактериального состава с помощью секвенирования гена 16S рРНК. Этот метод может помочь исследователю определить, какие бактерии содержатся в данном образце человека, и определить связь между конкретными бактериями и характеристиками хозяина или статусом заболевания. Несмотря на то, что этот метод был разработан для того, чтобы дать представление о вагинальных бактериальных сообществах человека, он также может быть применен для изучения бактериальных сообществ из других участков тела, таких как ноздри, рот, кожа и прямая кишка, а также из других организмов.

Обратите внимание, что в этом видео освещаются более сложные части протокола и не рассматривается часть секвенирования или анализ секвенирования. Бриттани Боуман, техник из моей лаборатории, продемонстрирует это. Начните эту процедуру с эктоцервикальных мазков, собранных и хранящихся на влажном льду, как описано в сопроводительном документе.

При подготовке к экстракции нуклеиновых кислот очистите все поверхности капюшона и все предметы, помещенные в колпак, с помощью отбеливателя, а затем обеззараживающего средства, которое удаляет РНКазы, ДНКазы и ДНК. В капюшон поместите по одной трубке для бусин на образец. В каждую пробирку добавьте 500 микролитров буфера NaCl-Tris-EDTA, 210 микролитров 20% SDS и 500 микролитров фенолхлороформа изоамилового спирта.

Осторожное обращение с тампонами имеет решающее значение для получения четких результатов с помощью этого протокола. Требуется немного практики, чтобы перенести тампон, не уронив его, и это проще, если вы используете тампон с полым стержнем, как этот. С помощью стерильных щипцов перенесите тампон из транспортной пробирки в трубку для бусин.

Тщательно потрите головку тампона о внутренние стенки трубки в течение не менее 30 секунд. Поставьте трубку на лед. Затем смените перчатки и повторите процедуру взятия мазка со следующим образцом.

После того, как все образцы будут энергично потерты, дайте им остыть на льду не менее 10 минут. По прошествии 10 минут для извлечения тампона придерживайте ручку стерильным пинцетом и с помощью чистого наконечника Р200 прижмите головку к внутренней стороне стенки трубки. Этот процесс с выделением жидкости из тампона, увеличивая восстановление нуклеиновых кислот.

Поместите трубку для бусин в бисерную машину и гомогенизируйте образец в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Затем центрифугируйте трубку для шариков при давлении 6 000 g и четырех градусах Цельсия в течение трех минут, чтобы измельчить мусор и разделить водную и фенольную фазы. После вращения обычно можно увидеть три фазы.

Верхний слой — это водная фаза, содержащая ДНК и РНК. Нижний слой представляет собой органическую фазу, содержащую липиды и мусор из клеток и тампонов. Тонкий белый средний слой, называемый интерфазой, содержит белок.

Переложите водную фазу, примерно от 500 до 600 микролитров, в стерильную 1,5-миллилитровую пробирку. Добавьте равный объем фенола, хлороформа, изоамиловый спирт. Перемешиваем методом инверсии и кратковременного вортексинга.

Центрифугируйте пробирку в течение пяти минут. После отжима переложите водную фазу в новую стерильную 1,5-миллилитровую трубку. Будьте осторожны, чтобы не перенести материал из интерфазы или нижележащей фенольной фазы.

Обратите внимание на переносимый объем и сохраните фенольную фазу для будущего выделения белка. Далее добавьте 0,8 объема изопропанола и 0,1 объема трех моляров ацетата натрия. Тщательно перемешайте путем инверсии и кратковременного вортекса.

Осаждайте нуклеиновую кислоту, охлаждая трубку при температуре 20 градусов Цельсия в течение как минимум двух часов и до ночи. После выпадения осадка центрифугируйте пробирку в течение 30 минут. После отжима осторожно с помощью пипетки удалите надосадочную жидкость, оставив гранулу нетронутой.

Добавьте 500 микролитров 100% этанола. Вытесните гранулу с помощью осторожного вортекса или пипетирования, не касаясь гранулы. Центрифугируйте в течение пяти минут.

С помощью пипетки P10 удалите и выбросьте как можно больше этанола, не потревожив гранулы. Высушите пеллеты на воздухе при комнатной температуре в течение 15 минут. Суспендируйте гранулу в 20 микролитрах буфера UltraPure 0.1X-Tris-EDTA.

Дайте образцу остыть на льду в течение 10 минут и проводите пипетку несколько раз, чтобы обеспечить полную ресуспендию. Измерьте концентрацию нуклеиновых кислот с помощью спектрофотометра. При желании отделите ДНК от РНК с помощью набора для очистки колонки в соответствии с протоколом производителя.

Постановка ПЦР является критически важным этапом в этой процедуре. Очень важно свести к минимуму загрязнение, обеспечив стерильность реагентов, ПЦР-капюшона и перчаток. Работайте быстро, но осторожно и используйте правильную технику при перемещении предметов в капот и из него.

Поместите в колпак чистую настольную решетку для микроцентрифужных пробирок и охладитель для ПЦР-планшетов. Наклейте на 8-луночные стрип-пробирки индивидуальные колпачки и поместите их в охладитель для ПЦР. Амплификация должна быть выполнена в трех экземплярах, и для каждой пары праймеров должен быть включен контроль воды без шаблона.

Поместите микроцентрифужную трубку в холодильник для мастер-смеси. Затем для каждого образца смешайте ультрачистую воду, 5X HF буфер, DNTP, прямой праймер 515F и 3% ДМСО, как описано в сопроводительном документе. Затем добавьте полимеразу в исходную смесь и перемешайте с помощью пипетирования.

В первую лунку добавляем 90 микролитров мастер-смеси и два микролитра обратной грунтовки, хорошо перемешиваем. Затем в четвертую лунку, которая служит бесшаблонным контролем, добавьте 23 микролитра мастера и два микролитра воды и перемешайте. Далее в первую лунку добавляем шесть микролитров соответствующей пробы.

Тщательно перемешиваем и переливаем во вторую лунку 25 микролитров. Поменяйте кончики, затем перелейте еще 25 микролитров из первой лунки в третью. Плотно закупорьте каждую лунку.

Будьте осторожны, чтобы не прикасаться к внутренней стороне лунок или крышке. Затем повторите этот процесс для каждого образца. После того, как все образцы будут подготовлены, быстро раскрутите полосковые пробирки, перенесите их в термоамплификатор и запустите программу.

После того, как прогон будет завершен, быстро раскрутите трубки, чтобы собрать жидкость со стенок. Затем на чистом лабораторном столе объедините тройные реакции ПЦР из каждого образца в маркированной стерильной микроцентрифужной пробирке. Переложите по 25 микролитров каждого без шаблонного контроля в отдельную стерильную пробирку.

Пока не комбинируйте ампликоны из разных образцов. Чтобы подтвердить успешную амплификацию ПЦР, загрузите пять микролитров каждого образца в 1,5%-ный агарозный гель и выполните электрофорез при напряжении 120 вольт в течение 30–60 минут. Рассмотрите гель под воздействием ультрафиолета.

Проверьте успешное усиление каждой выборки, отметив одну сильную полосу вокруг 380 пар оснований. Если имеется двойная полоса, повторно усилите образец другим обратным штрих-кодом. Если полосы нет вообще, повторно амплифицируйте образец с помощью того же обратного штрих-кода или праймера с новым обратным штрих-кодом.

Если повторная амплификация не увенчалась успехом, в образце могут присутствовать ингибиторы ПЦР, и в этом случае проведите очистку ДНК в колонке для удаления ингибиторов ПЦР. Храните оставшиеся 70 микролитров ампликона при температуре 20 градусов Цельсия. Отбросьте оставшиеся 20 микролитров элемента управления без шаблона, предполагая, что он не дал полосу.

Для создания ампликоновой ванны соедините от двух до пяти микролитров каждого ампликона в одной стерильной пробирке. Если полоса из сэмпла слабая, добавьте в два раза больше громкости относительно остальных сэмплов. Затем удалите праймеры ПЦР с помощью набора.

Если применимо, объедините пулы ампликонов без праймеров, чтобы создать окончательную библиотеку. Определить концентрацию ДНК в библиотеке можно с помощью спектрофотометра или флуориметрической системы. Наконец, разбавьте образцы до двух наномоляров и отправьте их на секвенирование.

Подробная информация о секвенс-анализе представлена в сопроводительном документе. Высококачественные ДНК и РНК были выделены, и ДНК была использована в качестве матрицы для ПЦР-амплификации области V4 гена 16S рРНК, как описано в этом видео. Гель-электрофорез был использован для подтверждения наличия одной полосы около 380 пар оснований в каждом образце, который был амплифицирован с помощью шаблона.

Элементы управления без шаблонов, работающие параллельно с одной и той же парой грунтов, не имели полосы. Затем ампликоны ПЦР объединяли в одну пробирку, количественно определяли и дополнительно разбавляли перед секвенированием. Здесь показана репрезентативная линейчатая диаграмма оценок качества последовательности в каждой позиции чтения.

Это нормально, когда качество последовательности падает после 200 пар оснований. Но средний показатель качества должен оставаться выше 30. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как выделить ДНК и РНК из мазков с помощью экстракции на основе фенолахлороформа, амплифицировать V4-область гена рибосомальной РНК 16SR и подготовить библиотеку для высокопроизводительного секвенирования.

После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно проявлять большую осторожность, чтобы предотвратить загрязнение во время сбора образца, экстракции нуклеиновых кислот и амплификации ПЦР. Не забывайте, что работа с фенолхлороформом может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вентилируемом капюшоне и ношение непроницаемых перчаток, защитных очков с боковыми щитками и лабораторного халата.