Иммобилизация Multi-биокатализаторов в альгинатные гранулы для регенерации кофактора и улучшены возможности повторного использования

Общая цель данной экспериментальной процедуры заключается в демонстрации использования сопряженной биокаталитической системы на основе целых клеток, иммобилизованных в альгинатных гранулах, для повышения выхода продукции и возможности повторного использования. В рамках данной работы были рассмотрены ключевые вопросы в области биокатализа, такие как иммобилизация биокатализаторов, их стабильность, регенерация кофакторов и использование биокатализаторов на основе целых клеток. Основным преимуществом данного метода является то, что он представляет собой простой, но гибкий подход к оптимизации производства многих важных биомолекул путями, зависящими от кофакторов.

В данном протоколе используются два рекомбинантных штамма E coli: SpNOx E coli, экспрессирующий NADH-оксидазу, и HjLAD E coli, экспрессирующий L-арабинитолдегидрогеназу. Поскольку процедура для обоих штаммов E coli идентична, она будет продемонстрирована только для HjLAD E coli.

Инокулируйте одну колонию E coli HjLAD в три миллилитра среды LB, дополненной 15 мкг/мл Ket-A-My-Sin, и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе-шейкере. На следующий день разведите культуру в соотношении 1:100 в 200 миллилитрах свежей среды LB, содержащей 15 мкг/мл Ket-A-My-Sin, и инкубируйте при 37 °C и 250 об/мин до достижения значения OD 600 около 0,6. Индуцируйте экспрессию белка HjLAD, добавив в культуральную среду 0,1 мМ IPTG, и инкубируйте при 25 °C и 200 об/мин в течение шести часов.

Соберите индуцированные клетки путем центрифугирования при 3200 ×g и температуре 4 °C в течение 20 минут. Удалите супернатант и перейдите к обработке клеточного осадка, как показано в следующем сегменте. Для начала этой процедуры мы отдельно суспендируем клеточные осадки E coli HjLAD и E coli SpNox в 50 мМ буфере Tris-Hcl при плотности клеток 5 г сухого веса клеток на литр.

В пробирку с круглым дном объемом 14 мл смешайте 600 мкл E. coli HjLAD с концентрацией 5 г сухого веса клеток на литр, 600 мкл E. coli SpNOx с концентрацией 5 г сухого веса клеток на литр, 100 мкл 20 мМ NAD+ и 150 мкл 2 М L-арибинитола. Доведите объем реакционной смеси до 2 мл, добавив 550 мкл 50 мМ Tris-HCl. Инкубируйте реакционную смесь при 30 °C и 200 об/мин в течение восьми часов.

Через восемь часов центрифугируйте смесь при 3200 ×g и 4 °C в течение 10 минут, затем соберите супернатант реакции. Для количественного определения продукции L-ксилулозы с помощью колориметрического анализа перенесите 100 µL собранного супернатанта в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 50 µL 1,5% цистеина, 900 µL 70% серной кислоты и 50 µL 0,1% Kar-Piz-All, растворенного в этаноле, и аккуратно перемешайте, трижды перевернув пробирку.

Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C и 200 RPM в течение 20 минут. Измерьте оптическую плотность реакционной смеси при 560 нм с помощью спектрофотометра. Начните протокол иммобилизации с приготовления 4% раствора альгината.

Добавьте 0,8 грамма альгината натрия в 20 миллилитров дистиллированной воды и нагрейте смесь до растворения альгината натрия. Добавьте 600 микронлитров суспензии E coli HjLAD с концентрацией 5 граммов сухого веса клеток на литр и 600 микронлитров суспензии E coli SpNOx с концентрацией 5 граммов сухого веса клеток на литр в 1,2 миллилитра 4% раствора альгината. Смешайте клетки и альгинат путем осторожного пипетирования, чтобы избежать образования пузырьков.

Для обеспечения формирования альгинатных гранул с однородным размером, морфологией и жесткостью критически важно медленно и по каплям добавлять суспензию клеток в альгинате с оптимального расстояния в достаточный объем раствора хлорида кальция, чтобы все гранулы были полностью покрыты. Наберите суспензию клеток в альгинате в шприц с помощью иглы, затем по каплям добавляйте смесь в 0,3 молярный раствор хлорида кальция в стакане объемом 100 миллилитров при постоянном перемешивании. Оставьте гранулы в растворе хлорида кальция на два-три часа при комнатной температуре без перемешивания для завершения процесса сшивания.

Слейте раствор хлорида кальция, не затрагивая гранулы, осторожно перелив его в коническую пробирку объемом 15 мл. Перенесите оставшиеся гранулы в другую коническую пробирку объемом 50 мл. Для удаления избытка хлорида кальция и неинкапсулированных клеток промойте гранулы 50 мМ буфером Tris-HCl.

Добавьте 10 миллилитров буфера к гранулам и оставьте суспензию в покое на три-пять минут. После того как гранулы осядут на дно, слейте буфер в другую емкость. Таким образом промойте гранулы три раза.

Не центрифугируйте гранулы на любом из этапов, иначе они разрушатся. Не утилизируйте использованный промывочный буфер Tris-HCl. Соберите 30 мл использованного промывочного буфера вместе с ранее собранным раствором хлорида кальция.

Осадите неиммобилизованные клетки E coli путем центрифугирования полученного раствора хлорида кальция и Tris-HCl при 3200 ×g в течение 20 минут. Перенесите промытые гранулы в пробирку. Затем оцените биосинтез L-ксилулозы, следуя процедуре, описанной для клеточного осадка, но используя все промытые гранулы вместо осадка клеток.

Для оценки стабильности иммобилизованных биокатализаторов при производстве L-ксилулозы соберите сформированные гранулы. Промойте их дважды 10 миллилитрами 50 миллимолярного Трис-HCl буфера без центрифугирования, как было показано ранее. Используйте все промытые гранулы для проведения реакции получения L-ксилулозы, как было продемонстрировано ранее.

Количественно определите выход L-ксилулозы с помощью колориметрического анализа, как было продемонстрировано ранее. Повторите реакцию синтеза L-ксилулозы для желаемого количества циклов продукции и измерьте количество L-ксилулозы, образовавшейся в супернатанте реакции в каждом цикле. Данная сопряженная биокаталитическая система на основе целых клеток способствует увеличению выхода L-ксилулозы.

При исходной концентрации L-арибинитола 150 мМ использование только биокатализатора HjLAD E coli обеспечило выход L-ксилулозы 79%. Для сравнения, использование клеток HjLAD E coli и SpNOx E coli в соотношении один к одному обеспечило выход L-ксилулозы 96%. Оценка параметров, влияющих на эффективность иммобилизации биокатализатора, показала, что эффективность увеличивается при повышении концентрации альгината натрия в диапазоне от одного до трех процентов.

Однако концентрации альгината натрия выше 2% приводят к снижению выхода L-ксилулозы. При использовании концентрации альгината натрия 2% оптимальная концентрация хлорида кальция для иммобилизации и максимального выхода L-ксилулозы была определена как 0.3 M. Была проведена оценка возможности повторного использования биокатализатора.

На данном графике производство L-ксилулозы в течение семи последовательных циклов повторного использования иммобилизованных и свободных сопряженных биокатализаторов на основе целых клеток показано темно-серым и светло-серым цветами соответственно. Хотя максимальный выход L-ксилулозы при использовании иммобилизованных сопряженных биокатализаторов на основе целых клеток ниже, чем в системе со свободными сопряженными клетками, иммобилизация улучшает возможность повторного использования. По завершении семи циклов последовательного применения иммобилизованные биокатализаторы сохранили стабильность и обеспечили 65% от исходного выхода L-ксилулозы.

После своей разработки этот метод открыл исследователям в области биокатализа возможность изучать выход продуктов полноценных многоклеточных биокатализаторов, а также основные реакции с участием кофакторов.