Оценка первичного нейрогенеза в Xenopus Эмбрионы Использование Иммунологическое

Общая цель этого эксперимента — обеспечить быструю и удобную визуализацию различных популяций нейронных клеток в развивающемся эмбриональном мозге xenopus. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области первичного нейрогенеза, такие как наблюдение за регуляцией процесса дифференцировки нейронов в центральной нервной системе xenopus. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет одновременно наблюдать за пулом предшественников нейральных стволовых клеток, а также за дифференцированным первичным нейронным пулом в рамках одного эксперимента.

Чтобы начать эту процедуру, осторожно отсасывайте от пяти до десяти эмбрионов из стеклянного флакона с помощью пластиковой или стеклянной пипетки, не вводя пузырьков воздуха. Перенесите эмбрионы в монтажную камеру и понаблюдайте под стереоскопом. Заполните монтажную камеру желатиновым раствором для обеспечения жесткости секционного блока.

Затем расположите эмбрионы рядом друг с другом с помощью пары щипцов с тонким кончиком. Отметьте ориентацию головы, нарисовав стрелку на краю камеры с помощью маркера, совместимого с криогенами. Для нескольких групп эмбрионов запишите описание каждой группы на краю соответствующей камеры.

Затем осторожно поместите камеру горизонтально в поролоновую коробку, наполовину заполненную сухим льдом. Закройте крышку и дайте монтажной камере замерзнуть по одной в течение пяти-десяти минут. После этого приступайте к криосекции или держите замороженные образцы при температуре 80 градусов Цельсия не менее одной-двух недель без потери иммуногенности.

В этой процедуре извлеките замороженный блок образца из камеры, надавливая на дно камеры с помощью тупой палочки или пальца. Затем добавьте несколько капель среды для замораживания тканей на диск для хранения образцов. Установите блок образцов передним концом эмбрионов вверх и дайте установленному блоку постоять внутри криостатной камеры в течение примерно одной минуты или до тех пор, пока среда для замораживания тканей не станет непрозрачной.

Немедленно установите диск для хранения образцов на микротом нижней стороной блока образцов вверх. Обрежьте часть блока образца с помощью лезвия, когда блок образца еще относительно мягкий. Затем оставьте диск для хранения образцов на микротоме не менее чем на пять минут, чтобы его температура достигла равновесия.

После этого постепенно обрезайте блок образца вниз, пока головы головастиков не станут видны через полупрозрачный желатин. Чтобы увеличить скорость обрезки, увеличьте толщину профиля. Контролируйте характеристики криостата, такие как острота и угол наклона лезвия, чтобы убедиться, что последующие секции образуются в виде длинной полосы.

Как только головы головастиков станут видимыми, отрегулируйте настройки криостата до нормального уровня, чтобы убедиться, что готовые ломтики могут образовывать полоски и не перекрываются и не прилипают к лезвию. Затем продолжайте обрезку до тех пор, пока головы головастиков не будут почти обнажены. Смахните все остатки срезов на сцене, прежде чем приступить к сбору образцов срезов.

Сделайте примерно от 10 до 15 секций и дайте им сформировать длинную полосу. Переверните толстую пластину покровного стекла в сторону и аккуратно снимите полоску с лезвия с помощью кисти с тонким кончиком. Далее расположите его на сцене длинной осью, параллельной лезвию.

Сделайте от 10 до 15 секций и дайте им сформировать длинную полосу, не ломаясь. Это может быть нелегко и требует практики. Одна из хитростей заключается в том, чтобы стараться не прикладывать слишком высокую скорость к маховику.

Скорее вращайте маховик осторожно и медленно. После этого выберите одну положительно заряженную горку комнатной температуры и подпишите ее карандашом. Затем быстро и плотно прижмите его к полосе маркировочной стороной вниз.

Впоследствии снимите предметное стекло с криостатной камеры. Повторите этот шаг, чтобы расположить от 20 до 30 фрагментов параллельно на каждом слайде. Высушите боковые стороны на воздухе в течение 10 минут, затем немедленно приступайте к процедуре иммуноокрашивания или храните предметные стекла в слайд-боксе при температуре 80 градусов Цельсия в течение трех-шести месяцев до проведения процедуры иммуноокрашивания.

Здесь мы можем увидеть соответствующие плоскости разреза переднего, среднего мозга, заднего мозга и спинного мозга головастика xenopus, которые будут использоваться для позиционирования для следующих изображений. Соответствующие поперечные срезы, которые были окрашены Anti-Sox 3, Anti-Acetylated Tubulin и DAPI, показывают относительное расположение пулов нейральных стволовых клеток, а также нейрофиламентов в нервной трубке. А вот соответствующие поперечные срезы, окрашенные Anti-MyT1 и DAPI, которые показывают относительное расположение дифференцированных первичных нейронов в нервной трубке.

После освоения этой техники ее можно сделать за два часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что необходимо обеспечить достаточное время охлаждения образца блока в сухом льду. В противном случае блок образца может быть недостаточно твердым и, следовательно, его будет трудно разрезать.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии развития к изучению нейронной дифференцировки в центральных нервных системах xenopus. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как делать срезы, и наблюдать за конкретными пулами нейронных клеток в центральной нервной системе ксенопуса.