Выделение и характеристика головы и шеи карцинома роговых клеток субпопуляции Имея стволовой клетки Характеристики

Общая цель этой процедуры заключается в выделении раковых стволовых клеток из плоскоклеточного рака головы и шеи или клеточных линий HNSCC. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области лечения рака о том, как использовать химиотерапию для преодоления радиорезистентности опухоли. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она использует комбинацию маркеров для достижения высокой специфичности в раковых стволовых клетках из клеточных линий HNSCC.

Демонстрировать процедуру будут Пресцилия Баттистон-Монтань, наш техник, и Марион Гилормини, доктор философии из моей лаборатории. Чтобы отобрать побочную популяцию раковых стволовых клеток с помощью анализа оттока красителя Хёхста, сначала пометьте одну коническую пробирку Хёхста и одну пробирку Хёхста и верапамила. Затем промойте культуру клеток HNSCC стерильным PBS с последующим добавлением одного миллилитра Tripsyn EDTA.

Через три минуты при 37 градусах Цельсия прекращают реакцию со свежей клеточной средой и подсчитывают клетки. Разбавляют культуру до одного умноженного на 10-седьмую клетки на миллилитр и завершают родительскую среду клеточной линии. Затем добавьте 100 микролитров в трубку Хёхста и Верапамиля и четыре миллилитра клеток в пробирку Хёхста.

Затем осторожно смешайте 10 микролитров пятимиллимолярного раствора верапамила гидрохлорида с образцом Хёхста и Верапамила, а затем с пятью микролитрами Хёхста в соотношении 10 до 10 до шестой клетки в обе пробирки. Затем накройте образцы алюминиевой фольгой и поместите их при температуре 37 градусов Цельсия. Через 90 минут при бережном перемешивании каждые 15 минут центрифугируйте пробирки и повторно суспендируйте гранулы в двух миллилитрах PBS.

После центрифугирования суспендируйте гранулы Хёхста и Верапамила в 500 микролитрах йодида пропидия в PBS, а гранулы Хёхста — в четырех миллилитрах того же центра. Теперь отфильтруйте образцы через 70-микронные сетчатые фильтры в пробирки FACS, чтобы удалить любые заполнители и поместить образцы на лед, защищенный от света. Затем загрузите образец Хёхста в проточный цитометр и откройте окно «Глобальный рабочий лист» в программном обеспечении проточного цитометра.

Нажмите «Точечная диаграмма», чтобы создать график на глобальном листе, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать параметры прямого и бокового рассеяния. Таким же образом создайте точечную диаграмму бокового рассеивания в ширину по высоте бокового рассеяния, а затем нажмите на многоугольный вентиль, чтобы создать область P1 на втором графике, чтобы выбрать отдельные ячейки и различить дублеты. Затем создайте красную область Хёхста с помощью синей точечной диаграммы и щелкните правой кнопкой мыши по ячейкам, чтобы выделить популяцию P1.

Затем создайте область P2 для выбора отрицательной популяции клеток с эффектом красителя Хёхста, которая отображается как боковое плечо слева от основной популяции клеток, и соберите 10 000 событий выборки Хёхста. Чтобы убедиться, что вентиль P2, представляющий боковую популяцию, расположен правильно, соберите также 10 000 выборочных событий Хёхста и Верапамила. Популяция побочного населения должна исчезнуть.

Затем отсортируйте побочную популяцию отрицательных красителей Хёхста в 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую один миллилитр полной раковой стволовой клеточной среды. В конце сортировки раскрутите клетки вниз и ресуспендируйте побочную популяционную гранулу в одном миллилитре свежей полной раковой стволовой клеточной среды. Затем подсчитайте клетки и засейте их в нужном количестве в новую колбу для клеточной культуры.

Чтобы выбрать подмножество CD44-high/ALDH-high из отсортированных боковых популяционных клеток, сначала пометьте семь стерильных 15-миллилитровых конических пробирок, как показано. Затем разбавьте отсортированные клетки до 10 умножить на семь клеток на миллилитр в среду стволовых клеток и распределить 100 микролитров клеток в неокрашенные пробирки CD44-APC и IGG1-APC и четыре миллилитра клеток в пробирки ALDH и CD44-APC, все на льду. Раскрутите элементы и повторно суспендируйте неокрашенные гранулы CD44-APC и IGG1-APC в 100 микролитрах буферной единицы из набора ALDEFLUOR.

Затем добавьте пять микролитров ингибитора ALDH DEAB в пробирки ALDH и DEAB и ALDH DEAB и CD44-APC. Ресуспендируйте клетки в пробирке ALDH и CD44-APC в четырех миллилитрах реагента С, содержащем четыре миллилитра буфера 1 и 20 микролитров реагента из набора, и немедленно перенесите 100 микролитров этих клеток в пробирки ALDH, ALDH и DEAB, а также ALDH DEAB и CD44-APC. Затем поместите все пробирки на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут, защищенную от света, перемешивая образцы через 15 минут путем легкого вортекса.

В конце инкубации центрифугируйте все образцы и выбросьте надосадочную жидкость. Затем поместите все пробирки на лед и ресуспендируйте гранулы ALDH и CD44-APC в четырех миллилитрах буфера А, гранулы CD44-APC и ALDH DEAB и CD44-APC в 100 микролитрах того же. Ресуспендируйте гранулу IGG1-APC в 100 микролитрах буфера B и неокрашенные пробирки ALDH и ALDH и DEAB в 100 микролитрах буферной единицы.

Через 10 минут снова открутите все образцы, а затем промойте в 1 миллилитре буфера один для всех образцов, кроме образца ALDH и CD44-APC, который промывается в четырех миллилитрах буфера. После второго центрифугирования ресуспендируйте все гранулы в одном миллилитре свежего буферного пера, за исключением образца ALDH и CD44-APC, который ресуспендирован в четырех миллилитрах буфера. Теперь загрузите пробирку ALDH и CD44-APC в проточный цитометр и создайте диаграмму APC с помощью точечной диаграммы для визуализации популяции с двойным окрашиванием.

Затем загрузите трубку ALDH, чтобы создать затвор для клеток с высоким уровнем ALDH. Положительные клетки должны исчезнуть при нагрузке трубки ALDH и DEAB. На том же графике создадим второй вентиль с помощью трубок CD44-APC и IGG1-APC для выбора ячеек с высоким уровнем CD44.

Положительные элементы исчезнут при загрузке трубки IGG1-APC. Затем загрузите пробирки ALDH и CD44-APC и ALDH DEAB и CD44-APC, чтобы создать третий затвор, включающий клетки с высоким уровнем CD44/ALDH. Используйте пробирку ALDH-CD44 с двойным окрашиванием, чтобы расположить последние ворота на двойных положительных клетках.

Затем отсортируйте CD44-высокие/ALDH-высокие клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую один миллилитр полной раковой стволовой клеточной среды, собрав CD44-низкие/ALDH-низкие клетки в одном миллилитре полной клеточной культуральной среды по желанию. После второй сортировки поместите клетки с высоким уровнем CD44/ALDH в соответствующую колбу для клеточной культуры с полной средой для стволовых клеток рака в инкубаторе для клеточных культур на 18–24 часа. Когда ячейки прикрепятся ко дну колбы, смените питательную среду и верните колбу в инкубатор.

Чтобы подтвердить опухолевый потенциал клеток с высоким уровнем CD44/ALDH, трипсинизируйте раковый стволовой монослой, как показано для получения суспензии одиночных клеток и переноса в 10 раз от 10 до шести клеток в коническую трубку объемом 15 миллилитров. После вращения клеток повторно суспендируют гранулу в среде с низким содержанием сыворотки с добавлением рекомбинантного эпидермального фактора роста человека гепарина и B27 и инкубируют клетки в чашке Петри с низким уровнем якоря в инкубаторе для клеточных культур до тех пор, пока опухолевые сферы не будут обнаружены с помощью оптической микроскопии. При первом проведении сортировки на новой клеточной линии необходимо подтвердить опухолевый потенциал клеточной линии, о чем свидетельствует ее способность образовывать опухолевые сферы в бессывороточной среде in vitro.

Кроме того, КПКР должна демонстрировать высокую экспрессию бета-катенина и других маркеров стволовых клеток клетками с высоким уровнем CD44/ALDH. Клетки CD44-высокого/ALDH-высокого уровня также должны быть способны образовывать опухоли in situ при введении в малых количествах по сравнению с клетками CD44-low/ALDH-low. После освоения каждая сортировка клеток должна быть завершена за пять часов, если она выполнена правильно.

При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости защищать маркированные флуорохромом образцы от прямого воздействия света. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализы миграции инвазий, чтобы ответить на дополнительные вопросы об участии раковых стволовых клеток в метастатическом процессе. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области рака к изучению механизмов побега опухоли при раке HNSCC.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить раковые стволовые клетки из клеточных линий HNSCC с помощью мультипараметрического, проточного цитометрического анализа и сортировки клеток. Не забывайте, что работа с опухолевыми клетками и интеркаляционными агентами ДНК может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата и перчаток.