Быстрый метод обработки крови для увеличения выхода плазмы пептидных уровней в крови человека

Общая цель этого метода RAPID заключается в повышении выработки эндогенных пептидных гормонов, которые должны быть измерены в крови человека. Метод RAPID был недавно разработан для использования на крысах, а также подходит для использования в крови человека. Метод RAPID повышает урожайность и позволяет определить правильную молекулярную форму эндогенного пептида.

Метод RAPID прост в использовании. Однако метод RAPID более трудоемкий и более дорогой по сравнению со стандартным забором крови. Так что это может быть более применимо в исследовательских условиях.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как своевременное разведение образцов, а также элюирование имеют большое значение для обеспечения надлежащего уровня пептидов. Соберите венозную кровь в стандартизированное время после ночного голодания из вены предплечья. И обрабатывать по стандартным процедурам, или по методу RAPID.

Проинструктируйте испытуемых не заниматься физическими упражнениями и не курить перед сдачей крови. Для стандартной обработки соберите кровь в охлажденные пробирки, содержащие ЭДТА, и центрифугируйте в течение 10 минут при 3000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость, и держите ее при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшей обработки методом радиоиммунного анализа.

Для обработки RAPID немедленно разбавьте кровь один к 10, в ледяном буфере RAPID. PH три целых шесть десятых, содержащий ноль целых одной молярной аммониязита. Ноль целых пять целых молярного натрия хлорида и ингибиторы ферментов.

В течение 10 минут центрифугируйте образец RAPID при давлении 3000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Далее зарядите картриджи для хроматографии со 100% актитонитрилом, со скоростью 10 миллилитров в минуту. После уравновешивания с 0,1% трифторуксусной кислоты, или ТЖК.

Загрузите надосадочную жидкость RAPID с постоянной скоростью один миллилитр в минуту с помощью шприцевого насоса. После промывки картриджей с тремя миллилитрами 0,1% ТФК, со скоростью 10 миллилитров в минуту, медленно разбавьте образец RAPID двумя миллилитрами 70% ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA, со скоростью два миллилитра в минуту. Высушите элюированные образцы с помощью вакуумного центрифугирования, и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия, до дальнейшей обработки методом радиоиммунного анализа.

Получить йод-125 радиоактивно меченые пептиды человека. Храните пептиды в виде порошка до начала эксперимента. Затем в свежем виде разведите в 0,1% уксусной кислоте.

Для стандартной обработки, сразу после забора крови, в охлажденные пробирки, содержащие ЭДТА, перелейте один миллилитр крови в пробирку с 50 микролитрами радиоактивной метки, содержащей от 3000 до 6000 CPM. Для обработки RAPID переведите один миллилитр крови ЭДТА в пробирку, содержащую девять миллилитров буфера RAPID, а 500 микролитров радиоактивной метки содержат от 30 000 до 60 000 CPM. Благодаря разведению от одного до 10 используйте в 10 раз больший объем радиоактивной метки для обработки RAPID.

Сразу после применения различных этапов метода RAPID оцените восстановление радиоактивно меченых пептидов с помощью гамма-счетчика. Не сушите образцы вакуумным центрифугированием и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Для измерения переносим надосадочную жидкость на трубки, вставляемые в гамма-счетчик

И оцените количество в минуту. Измерьте всю надосадочную жидкость в стандартных образцах. В образцах RAPID проанализируйте одну десятую от общего объема, чтобы получить сопоставимое количество используемой радиоактивной метки.

В качестве 100% стандарта используйте два образца с 50 микролитрами пептида йода-125, меченного радиоактивными метками, которые не подвергаются обработке. Измерьте радиоактивность всех образцов одновременно. Возьмите кровь в охлажденных пробирках, содержащих ЭДТА, и переложите один миллилитр в пробирки, содержащие 200 микролитров меченого ацилгрелина, содержащего от 15 000 до 20 000 CPM, для стандартной обработки.

Для обработки RAPID перелейте один миллилитр крови в пробирку, содержащую девять миллилитров быстрого буфера, и 200 микролитров радиоактивно меченного ацилгрелина, содержащего от 15 000 до 20 000 CPM. После этого обработайте образцы, как и раньше. Для дальнейшего анализа с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой необходимо непосредственно загрузить образцы в колонку со стабильной связью C18, уравновешенную по 17% ацетонитрилу в воде с добавлением 0,1% TFA.

После пяти минут уравновешивания используйте градиент от 17 до 40% ацетонитрила, чтобы элюировать образец за 40 минут, со скоростью один миллилитр в минуту. Собирайте доли одного миллилитра каждую минуту и анализируйте радиоактивность с помощью гамма-счетчика. В отдельном эксперименте загрузите 200 микролитров меченого ацилгрелина, содержащего от 15 000 до 20 000 CPM, непосредственно в колонку и выполните ВЭЖХ, как и раньше.

Для проведения радиоиммунного анализа замораживают замороженные надосадочные жидкости и высушивают порошок в вакууме при комнатной температуре. Непосредственно перед радиоиммунным анализом суспендировать суспендию сухих образцов RAPID в воде двойной дистилляции, в соответствии с исходным объемом плазмы. Оцените кисспептин и общий грелин, а также ацилгрелин, используя коммерческие радиоимуноанализы в соответствии с протоколами производителя.

Используйте боросиликатные трубки, которые обеспечивают стабильное формирование палитры. В первый день инкубируйте образцы с буфером для анализа и первичным атибоди в разведении, предоставленном производителем, в течение 24 часов. На второй день добавьте индикатор йода-125, вортекс и инкубируйте в течение 24 часов.

На третий день добавьте перципитающий реагент, вихрь и инкубируйте в соответствии с рекомендациями производителя. Затем центрифугируйте пробирки при давлении 3000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и подсчитайте радиоактивность в палитрах с помощью гамма-счетчика.

Рассчитайте десацил грелин как разность общего грелина за вычетом ацил грелина. Оценивает соотношение ацил, десацил грелин, путем погружения ацил за десацил грелином для каждого отдельного образца. По возможности обрабатывайте все образцы в одной партии, чтобы избежать вариабельности между анализами.

Быстрая обработка крови увеличивает выход радиоактивно меченых пептидов йода-125 в крови человека по сравнению со стандартной обработкой крови. После стандартной обработки крови восстановление радиоактивно меченых пептидов варьировало от 48% до 68% в девяти пептидах. Обработка RAPID улучшила выход всех меченых йодом 125 пептидов, с восстановлением в диапазоне от 71% до 98%. Здесь показан профиль элюирования меченного йодом 125 ацилгрелина в крови человека после стандартной обработки крови или обработки RAPID.

После обработки RAPID меченный грелином йод-125 ускользал в ожидаемом положении. В то время как после стандартной процедуры наблюдался более ранний пик. Вероятно, соответствует десацил грелину.

Это представляло собой 62%-ную деградацию пептида. Обработка крови RAPID улучшает соотношение ацил, десацил грелин по сравнению со стандартной обработкой. После обработки RAPID соотношение ацил, десацил грелин в крови субъектов с нормальной массой тела составляло один к трем.

По сравнению с 1 к 23 после стандартной обработки крови. Аналогичные результаты наблюдались при анорексии и ожирении. Быстрая обработка крови приводит к повышению уровня эндогенного кисспептина в крови по сравнению со стандартной обработкой.

Как у пациентов с анорексией, так и у пациентов с нормальной массой тела, уровни циркулирующего эндогенного кисспептина были значительно выше после RAPID по сравнению со стандартной обработкой. Разница не достигала значимости в условиях ожирения. После того, как эта техника будет освоена и выполнена должным образом, она может быть выполнена менее чем за один час.

Этот метод особенно важен, когда ожидаемая концентрация пептида низкая, или различия между группами невелики. Общая рекомендация по пептидам не может быть дана. Потенциальная польза для каждого пептида должна быть проверена один раз в самом начале.

Этот метод прокладывает путь для исследователей в различных областях для изучения выхода и, что более важно, правильной молекулярной формы эндогенных пептидных гормонов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как применять метод RAPID для обработки крови у человека.