Glycan Узел Анализ: снизу вверх подход к Glycomics

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы расщепить все гликаны в биологическом образце с сохранением состава моносахаридов и информации о связях. Облегчение дистилляции интересных гликановых особенностей, таких как болезненное циалирование и деление N-ацетилглюкозамина на отдельные аналитические сигналы. Этот метод может помочь напрямую ответить на ключевые вопросы в области гликомитов, например, какие уникальные свойства гликана изменяются при определенных болезненных состояниях.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что свойства гликанов, которые имеют тенденцию изменяться при таких заболеваниях, как ветвление бета-1-6 и корфулькосуляция, дистиллируются в отдельные аналитические сигналы, а не распространяются на несколько интактных гликанов. Как правило, люди должны использовать этот метод, чтобы действительно бороться с плохим содержанием N-ацетилцистеинов из-за неправильной обработки свежеперметилированных гликанов. Подготовьте образцы, сначала переложив девять микролитров каждого биологического аналита в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитров

К каждому образцу добавьте один микролитр деионизированной воды и 270 микролитров ДМСО высокой чистоты. И энергично перемешивайте, перемешивая их. После подготовки образца соберите спиновые колонки, загруженные гидроксидом натрия, как описано в текстовом протоколе.

С помощью аналитического шприца добавьте в каждый анализируемый раствор по 105 микролитров йодметана и немедленно закупорьте пробирки. Тщательно обработайте образцы вихрем. Отключите от сети предыдущие подготовленные спиннинговые колонки и центрифугируйте их в течение 15 секунд при давлении 2 400 G. После утилизации пробирок резервуара и дренажа снова закупорьте колонки и поместите их внутрь нового набора пробирок, помеченных для каждого анализируемого вещества.

Используйте трубную головку объемом 1000 микролитров для переноса каждого раствора аналита на соответствующую спиновую колонку. После добавления раствора аналита отожмите около двух миллилитров с конца наконечника трубки объемом 200 микролитров и оставьте наконечник в колонне, чтобы использовать его в качестве мешалки. Используйте наконечники трубных головок, чтобы осторожно помешивать колонны раз в две-три минуты.

Через 11 минут отключите колонки от сети и центрифугируйте их в течение 15 секунд при давлении 2 400 G. Немедленно снимите спиновые колонки и поместите их в новые пробирки резервуара, сохранив проточный раствор, но выбросив пробки. В колонки добавьте 300 микролитров ацетонитрила и центрифугируйте их 30 секунд при 9 600 G. Теперь переложите первые перметилированные проточные растворы в пробирки из силанированного стекла, содержащие 3,5 миллилитров буфера фосфата натрия. Убедитесь, что перенесенный материал чист и что не переносится твердый материал.

На дне пластиковых трубок образуется маленькая белая гранула. Избегайте переноса любого очевидного твердого материала. Невыполнение этого требования приведет к низкому выходу N-ацетилцистеин-глюкозаминовых гликанов.

каждый образец в партии после того, как все образцы будут перемещены. Затем соедините проточные растворы ацетоненитрила с остальной жидкостью в соответствующих пробирках. Опять же, избегайте переноса твердого белого остатка на этом этапе.

Укупорить, встряхнуть и сделать вихревой раствор непосредственно перед переходом к следующему образцу. После перметилирования добавьте по 1,2 миллилитра хлороформа в каждую пробирку внутри вытяжного шкафа. Затем закройте пробирки крышками и энергично перемешайте содержимое.

Чтобы разделить слои, кратковременно центрифугируйте растворы при давлении 3 000 G. Используйте головку пастбищной трубы, чтобы извлечь и отбросить большую часть верхнего водного слоя, оставив около трех миллилитров слоя. Добавьте 3,5 миллилитра 0,2 молярного буфера фосфата натрия, а затем закупорьте, перемешайте и центрифугируйте пробирку. Выполните этот этап экстракции жидкость/жидкость в общей сложности три раза.

Оставляя около одного миллилитра водного слоя в окончательной экстракции. Теперь используйте чистую головку силанизированной пастбищной трубы, чтобы осторожно перенести слой хлороформа в чистую и маркированную пробирку из силанизированного стекла, как описано в текстовом протоколе. В предварительно нагретом испарительном коллекторе, настроенном на 75 градусов Цельсия, высушите образцы под слабой струей газообразного азота.

Следите за тем, чтобы поток газа возмущал поверхность жидкости, но не разбрызгивал ее. Как только образцы высохнут, они готовы к гидролизу. Добавьте 325 микролитров 2 моляра трифторуксусной кислоты или ТЖК в каждый образец и хорошо перемешайте.

Плотно закройте каждую пробирку с образцами сразу после добавления ко всем образцам, чтобы предотвратить испарение ТФК и потерю образца на последующем этапе нагрева. Инкубируйте образцы при температуре 121 градус Цельсия в течение двух часов, чтобы гидролизировать гликаны. Пока образцы инкубируются, снова подготовьте испарительный коллектор при температуре 75 градусов Цельсия.

После инкубации образцы высушить под постоянным потоком азота в испарительном коллекторе. Регулярно проверяйте образцы, чтобы убедиться, что они высушены с использованием минимально возможного времени сушки. К каждой пробе добавьте 475 микролитров боргидрида натрия по 10 грамм на литр.

А затем тщательно перемешайте образцы, чтобы растворить остатки. Закройте пробирки крышками и дайте восстановительной реакции продолжаться в течение одного часа. Далее добавьте в каждую пробу по 63 микролитра метанола.

Перемешайте, а затем высушите образцы при температуре 75 градусов Цельсия под азотом. Добавьте 125 микролитров метанола в раствор уксусной кислоты в каждый образец. Перемешайте, а затем снова высушите образцы при температуре 75 градусов Цельсия под азотом.

Убедитесь, что образцы полностью высохли, поместив их под вакуум на 20 минут. После высыхания добавьте в каждый образец по 18 микролитров деионизированной воды. Затем быстро центрифугируйте образцы и хорошо перемешайте их, чтобы растворить осадок.

Далее добавьте в каждую трубку по 250 микролитров уксусного ангидрида. Закройте пробирки, тщательно закрутите и обработайте образцы ультразвуком на водяной бане в течение двух минут, чтобы обеспечить полное растворение любых остатков. Затем инкубируйте образцы при температуре 50 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Теперь добавьте 230 микролитров концентрированных ТФК в каждый образец. После укупорки и смешивания образцов инкубируйте их в течение 10 минут при внутренней температуре 50 градусов Цельсия. Добавьте по 1,8 миллилитра дихлорметана в каждую пробу и хорошо перемешайте.

Далее добавьте в пробирку два миллилитра диионизированной воды и дважды выполните экстракцию жидкость/жидкость. Восстановите слой дихлорметана с помощью силанизированной головки пастбищной трубы. Переложите в флакон с автоматическим пробоотборником, а затем высушите образец под азотом при температуре 74 градуса Цельсия.

Перед ГХ-МС восстановите образцы с помощью 120 микролитров ацетона, укупорьте и тщательно перемешайте их. В режиме разделения используйте автоматический пробоотборник для введения одного микролитра каждого образца в вкладыш для раздельного сплава GC. Для времяпролетных масс-спектрометров рекомендуется раздельное соотношение сорока и газообразного гелия в режиме постоянного потока при 0,8 миллилитров в минуту.

Проанализируйте образец с помощью двухступенчатого градиента, достигающего 325 градусов по Цельсию. Подвергните ускользающие компоненты образца электронной ионизации. Для времяпролетного массоанализатора анализируют фрагменты M свыше Z от 40 до 800 с частотой суммирования импульсов 0,1 секунды.

Чтобы продемонстрировать чувствительность этого протокола, биологический образец был тщательно обработан. Полученная хроматограмма дает достаточную интенсивность между желаемыми пиками продукта для удобства сравнения и анализа. Затем тот же исходный биологический образец был обработан по той же процедуре.

Но белый осадок в растворе перметилирования, который прокручивали через колонку NAOH, переносился в последующую смесь для экстракции жидкость/жидкость. Хроматограмма дает различное соотношение пиковой интенсивности одних и тех же ключевых продуктов образца. При прямом сравнении разница разительна.

Явное углубление 4-позиционного связанного пика N-ацетилглюкозамина на второй хроматограмме является узнаваемым признаком неудачного перметилирования и экстракции. Чтобы оценить полезность этого подхода для выявления различий в составе гликанов при заболеваниях, экстрагированные ионные хроматограммы из нормального образца плазмы крови и образца плазмы крови онкологического пациента нормализуются для 2-сцепленного маноса и накладываются. Количественные различия в уникальных свойствах гликанов, таких как бета-1-6 ветвление, а также больной циалирование, очевидны.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить анализ гликанового узла снизу вверх. Облегчение дистилляции интересных гликановых особенностей, таких как корфулкозолирование, больное циалирование и деление гликанита на два уровня в отдельные аналитические сигналы.