Исследование функции Coronin А в раннем Реакция использовать голод

Общая цель данной экспериментальной процедуры заключается в исследовании раннего ответа на голодание у Dictyostelium discoideum, зависящего от белка Coronin-A. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как идентификация сигнальных путей и факторов, участвующих в раннем развитии Dictyostelium discoideum. Основным преимуществом данной методики является то, что она может стать инструментом для автоматизированного высокопроизводительного скрининга факторов, индуцирующих развитие, и белков, участвующих в ранней сигнальной передаче при развитии.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями из-за множества переменных, присущих этому анализу, таких как плотность клеток, время адгезии и время проявления. Для начала данной процедуры культивируйте клетки DH1.10 или клетки с дефицитом corA в колбе Эрленмейера со средой HL-5 при температуре 22 °C в shaking-инкубаторе при 160 rpm. Поддерживайте плотность клеток в диапазоне от 1×10⁴ до 2×10⁶ клеток/мл.

Для изучения агрегации клеток соберите от 10 до 50 миллилитров клеток DH1.10 или клеток с дефицитом corA, полученных на базе штамма DH1.10, находящихся в логарифмической фазе роста. Центрифугируйте их в течение трех минут при 400 ×g. Затем дважды промойте клетки в BSS.

После этого подсчитайте количество клеток с помощью лейкоцитометра. Затем высейте клетки в 24-луночный планшет. Дайте им прикрепиться в течение одного часа при 22 °C в BSS.

Затем визуализируйте агрегацию клеток с помощью таймлапс-микроскопии, делая снимки каждые 135 секунд. Чтобы изучить влияние внешне прикладываемых импульсов циклического АМФ на развитие клеток DH1.10 или клеток DH1.10 с дефицитом corA, соберите от 10 до 50 миллилитров клеток и центрифугируйте их в течение трех минут при 400 ×g. После этого дважды промойте их в BSS.

Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Затем повторно суспендируйте клетки в BSS до плотности 1 × 10⁷ клеток на мл. После этого перемешивайте культуры при 22 °C в течение двух часов при 160 об/мин перед подачей импульсов.

Затем подайте импульсы циклического АМФ с помощью перистальтического насоса, управляемого таймером. Запрограммируйте насос так, чтобы он подавал пятисекундный импульс циклического АМФ каждые шесть с половиной минут в течение пяти часов. Критически важным моментом является обеспечение того, чтобы наконечник для введения циклического АМФ не был постоянно погружен в раствор, а погружался периодически за счет волн, создаваемых шейкером.

После добавления циклического АМФ снова подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Затем распределите клетки по 24-луночному планшету и дайте им прикрепиться в течение одного часа в BSS. Через 16 часов визуализируйте агрегацию клеток при 22 °C с помощью микроскопии в светлом поле с использованием пятикратного объектива.

В данном методе приготовьте свежую кондиционированную среду, собрав клетки DH1.10 или клетки DH1.10 с дефицитом corA в логарифмической фазе роста из встряхиваемых культур в среде HL5 при 22 °C. Центрифугируйте клетки в течение трех минут при 400 ×g. После этого промойте их трижды в PBM.

Затем подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. После этого ресуспендируйте их в PBM до плотности 1×10⁷ клеток/мл и перемешивайте в течение 20 часов при 22 °C со скоростью 110 об/мин. Далее центрифугируйте клетки при 400 ×g в течение трех минут, после чего соберите кондиционированную среду. Затем очистите среду путем центрифугирования при 8 000 ×g в течение 15 минут при 4 °C.

Затем профильтруйте кондиционированную среду через фильтр с порами 0,45 мкм и разведите ее трехкратно в PBM. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра, распределите их по 24-луночному планшету и оставьте для адгезии на один час при 22 °C. После этого замените супернатант клеток ранее приготовленной кондиционированной средой.

Через 16 часов визуализируйте агрегацию клеток с помощью светлопольной микроскопии, используя объектив с пятикратным увеличением. Здесь клетки с дефицитом Coronin-A демонстрируют дефект на ранней стадии развития и оказались неспособны формировать многоклеточные агрегаты, что является начальным этапом цикла развития Dictyostelium discoideum. На данном рисунке вегетативные клетки дикого типа и клетки с дефицитом corA были промыты и подвергнуты голоданию в течение двух часов, после чего в суспензии каждые шесть с половиной минут в течение пяти часов проводились импульсные воздействия 15 animal или циклического АМФ (или их отсутствие).

Применение импульсов экзогенного циклического АМФ полностью восстановило фенотип дикого типа. На данном рисунке экспоненциально растущие клетки дикого типа и клетки с дефицитом corA были промыты в PBM, высеяны в многолуночные планшеты и инкубированы в кондиционированной среде, полученной от голодающих клеток дикого типа или клеток с дефицитом corA. Изображения были сделаны через 16 часов после высева клеток.

Dictyostelium discoideum с дефицитом corA были способны вырабатывать все факторы, необходимые для индукции развития, но не могли реагировать на них. После освоения эта методика может быть выполнена за 20 часов, включая время инкубации, при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно помнить, что для разных штаммов потребуется корректировка нескольких переменных анализа, таких как плотность клеток, время адгезии и время развития.

После выполнения данной процедуры можно провести биохимическое фракционирование с последующим протеомным анализом для идентификации факторов, участвующих в раннем ответе Dictyostelium discoideum на голодание. После просмотра этого видео зритель должен хорошо понимать, как индуцировать раннее развитие Dictyostelium discoideum в условиях погружения, используя либо кондиционированную среду, либо импульсы циклического АМФ.