Исследование функции Coronin А в раннем Реакция использовать голод Dictyostelium discoideum Агрегацией Assays

Общая цель этой экспериментальной процедуры состоит в том, чтобы исследовать коронин-А-зависимую раннюю реакцию на голодание Dictyostelium discoideum. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как идентификация сигнальных путей и факторов, участвующих в раннем развитии Dictyostelium discoideum. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может предоставить инструмент для автоматизированного и высокопроизводительного скрининга факторов, индуцирующих развитие, и белков, участвующих в передаче сигналов на ранних этапах развития.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за множества переменных, присущих анализу, таких как плотность клеток, время адгезии и время развития. Чтобы начать эту процедуру, выращивайте клетки DH1.10 или клетки с дефицитом корА в колбе Эрленмейера, содержащей среду HL-5, при температуре 22 градуса Цельсия в встряхивающем инкубаторе при 160 оборотах в минуту. Поддерживайте плотность клеток от одного до 10 до четырех и от двух до 10 до шести клеток на миллилитр.

Чтобы изучить агрегацию клеток, соберите от 10 до 50 миллилитров клеток DH1.10, растущих в логарифмической фазе, или клеток с дефицитом corA, полученных в фоновом состоянии DH1.10. Центрифугируйте их в течение трех минут при 400 умноженных на изб. Затем дважды были клетки в БСС.

После этого подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Затем поместите ячейки в 24-луночную пластину. Дайте им прилипнуть в течение часа при температуре 22 градуса Цельсия в BSS.

Затем визуализируйте агрегацию клеток с помощью покадровой микроскопии и делайте снимки каждые 135 секунд. Чтобы изучить влияние циклических импульсов АМФ на развитие клеток DH1.10 или клеток с дефицитом корА DH1.10, соберите от 10 до 50 миллилитров клеток и центрифугируйте их в течение трех минут при 400-кратном избежении. После этого постирайте их дважды в BSS.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Затем повторно суспендируйте клетки до плотности от одного до 10 до семи клеток на миллилитр в BSS. Затем встряхните культуры при температуре 22 градуса Цельсия в течение двух часов при 160 об/мин перед применением импульсов.

Затем подайте циклические импульсы АМР с помощью перистальтического насоса, управляемого таймером. Запрограммируйте насос на подачу пятисекундного импульса циклического АМФ каждые шесть с половиной минут в течение пяти часов. Критически важным шагом является обеспечение того, чтобы наконечник циклического впрыска АМФ не был постоянно погружен в раствор, а только периодически погружался в волны, генерируемые вибростендом.

После циклического применения АМФ снова подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Затем поместите ячейки в 24-луночную пластину и дайте им прилипнуть в течение одного часа в BSS. Через 16 часов визуализируйте агрегацию клеток при температуре 22 градуса Цельсия с помощью светлопольной микроскопии с использованием пятикратного субъективного метода.

В этой процедуре готовят свежую кондиционированную среду путем сбора клеток логарифмической фазы DH1.10 или клеток с дефицитом DH1.10 из культур встряхивания средой HL5 при температуре 22 градуса Цельсия. Центрифугируйте клетки в течение трех минут при 400-кратном избежании. После этого постирайте их трижды в ПБМ.

Затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, затем повторно суспендируйте их в PBM с плотностью один умножить на 10 до семи клеток на миллилитр и встряхните их в течение 20 часов при температуре 22 градуса Цельсия при 110 оборотах в минуту. Затем центрифугируйте клетки при 400-кратном g в течение трех минут, после чего собирайте кондиционированную среду. После этого осветлите среду центрифугированием при 8 000 умноженных на g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Затем отфильтруйте кондиционированную среду через фильтр 0,45 микрометра и разбавьте ее в трех размерах PBM. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, поместите их в 24-луночную пластину и дайте им прилипнуть в течение одного часа при температуре 22 градуса Цельсия. Далее замените надосадочную жидкость клеток на заранее приготовленную кондиционированную среду.

Через 16 часов визуализируйте агрегацию клеток с помощью светлопольной микроскопии с использованием пятикратного субъективного показателя. Здесь клетки с дефицитом коронина-А демонстрируют дефект в раннем развитии и не могут образовывать многоклеточные агрегаты, что является начальным этапом цикла развития Dictyostelium discoideum. На этом рисунке вегетативные клетки дикого типа и клетки с дефицитом корА промывали и морили голодом в течение двух часов, прежде чем их пульсировали 15 животными или циклическими АМФ каждые шесть с половиной минут в течение пяти часов в суспензии.

Применение экзогенных циклических импульсов АМФ, полностью восстановило фенотип типа Wild. На этом рисунке экспоненциально растущие клетки типа Wild и клетки с дефицитом корА промывали в PBM, засеивали в многолуночные планшеты и инкубировали в кондиционированной среде, полученной из клеток типа Wild или голодающих клеток с дефицитом корА. Изображения были сделаны через 16 часов после посева клеток.

corA-дефицитные Dictyostelium discoideum, были способны вырабатывать все необходимые факторы для индукции развития, но не могли на них реагировать. После освоения этой методики ее можно сделать за 20 часов, включая время инкубации, если она выполнена правильно. При проведении этой процедуры важно помнить, что для разных штаммов потребуется корректировка нескольких переменных анализа, таких как плотность клеток, время адгезии, время развития.

После этой процедуры может быть выполнено биохимическое фракционирование и последующий протеомный анализ с целью выявления факторов, участвующих в ранней реакции на голодание Dictyostelium discoideum. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как индуцировать раннее развитие Dictyostelium discoideum в условиях погружения, используя как кондиционированные среды, так и циклические импульсы АМФ.