Методы исследования Mrp4 содержащих макромолекулярных комплексов в регуляции миграции фибробластов
19 мая 2016 г.
MRP4 регулирует различные циклические нуклеотид-зависимой сигнализации событий, включая недавно выяснены роль в миграции клеток. Мы описываем прямой, но многогранный подход к распутать вниз по течению молекулярные мишени из MRP4 что приводит к идентификации уникального MRP4 интерактома, который играет ключевую роль в отлаженной регулирования миграции фибробластов.
Общая цель этой экспериментальной процедуры заключается в наблюдении циклической АМФ-зависимой регуляции миграции фиброгаза с помощью MRP4. Высококонтактная микроскопия может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии. Например, в дополнение к приданию устойчивости к микробам, MRP4 также может регулировать физиологические процессы, такие как миграция клеток, модулируя внутриклеточную циклическую концентрацию нуклеотидов. Основное преимущество FRET-визуализации, которое мы собираемся попробовать сегодня, заключается в том, что она позволяет отслеживать внутриклеточную динамику циклического АМФ и циклической АМФ-зависимой киназы в режиме реального времени. Значение высококонтактной микроскопии заключается в том, что она может быть использована при разработке лекарств. После того, как система настроена, все инструменты настроены, в эту задачу на основе пластин не требуется никакого вмешательства человека. Хотя этот метод может дать представление о миграции клеток, он может быть применен к другим системам, таким как нераздельное производство липеклеточных клеток, высококонтактная визуализация уничтожения иммунных клеток, более холодное разведение, ангиогенез, пролиферация клеток, хемотаксис и лечение филлита. Чтобы подготовить клетки к высококонтактной микроскопии под колпаком для клеточных культур, используйте однопроцентный раствор фибронектина в PBS для покрытия лунок 96-луночного планшета. Инкубация планшета в CO2-инкубаторе при 37
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
MRP4 участвует в регуляции сигнальных событий, зависящих от циклических нуклеотидов, и играет важную роль в миграции клеток. В данном исследовании определен уникальный интерактом MRP4, который необходим для регуляции миграции фибробластов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Миграция клеток
- Сигнальные пути
- Биология фибробластов
Теоретическая часть
- MRP4 представляет собой транспортер, который влияет на различные сигнальные пути.
- Понимание роли MRP4 может дать представление о механизмах миграции клеток.
- Фибробласты играют ключевую роль в восстановлении и регенерации тканей.
- Идентификация интеракторов MRP4 может помочь в поиске новых терапевтических мишеней.
Цель исследования
- Выявить нижележащие молекулярные мишени MRP4.
- Изучить роль MRP4 в миграции фибробластов.
- Охарактеризовать интерактом MRP4.
Используемые методы
- Идентификация интеракторов MRP4 с помощью биохимических анализов.
- Анализ сигнальных путей, на которые влияет MRP4.
- Анализы миграции клеток для оценки функциональных результатов.
- Использование методов молекулярной биологии для изучения белок-белковых взаимодействий.
Основные результаты
- Идентификация уникального интерактома, связанного с MRP4.
- Демонстрация роли MRP4 в регуляции миграции фибробластов.
- Представление о сигнальных путях, модулируемых MRP4.
- Потенциальное значение для терапевтических стратегий, направленных на миграцию клеток.
Выводы
- MRP4 является критически важным регулятором миграции фибробластов.
- Интерактом MRP4 открывает новые направления для исследований.
- Понимание роли MRP4 может привести к достижениям в терапии восстановления тканей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Понимание регуляции миграции фибробластов, опосредованной MRP4, дает представление о механизмах передачи сигналов циклических нуклеотидов в контексте восстановления тканей. Данная работа способствует валидации мишени путем картирования протеомных интерактомов, которые модулируют фенотипы миграции, имеющие значение для фиброза и заживления ран. Такой подход позволяет снизить механистические риски при рассмотрении MRP4 в качестве мишени в доклинических моделях стромальной активации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: выявление ассоциированных с MRP4 белковых комплексов, которые функционально связывают активность транспортера с ремоделированием цитоскелета через F-actin.
- Практическая ценность: возможность исследования MRP4-зависимых сигнальных узлов с использованием коиммунопреципитации и масс-спектрометрии для снижения рисков при выборе мишеней.
- Научная ценность: уточнение роли MRP4 в регуляции уровней cAMP/cGMP, что связывает функцию транспортера с PKA-зависимым контролем миграции.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обоснование использования анализов миграции фибробластов в качестве функционального метода считывания для скрининга модуляторов MRP4 в 96-луночном формате.
- Операционная ценность: Поддержка рабочих процессов высококонтентного имиджинга для визуализации активности PKA в реальном времени с помощью FRET-биосенсоров в мигрирующих клетках.
- Научная ценность: Определение целостности актинового цитоскелета и активности PKA в качестве необходимых эффекторов, находящихся ниже по каскаду от MRP4 в анализах миграции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Определяет MRP4 как модулятор миграции фибробластов, имеющий значение для стромальной активации в моделях фиброза и восстановления тканей.
- Практическая ценность: Предоставляет релевантную заболеванию систему для оценки соединений, нацеленных на MRP4, с целью модуляции миграционного фенотипа в доклинических условиях.
- Научная ценность: Связывает потерю функции MRP4 с повышением уровня циклических нуклеотидов и усилением миграции, что подтверждает валидацию мишени в соответствии с биомаркерами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод поддерживает рабочие процессы раннего поиска путем сопоставления профилирования интерактома MRP4 с функциональными результатами миграции, что обеспечивает перевод мишени в анализ в рамках программ по изучению биологии стромы.
- Открывающая биология: Облегчает проверку гипотез о взаимодействующих белках MRP4 в сигнальных путях cAMP/PKA, регулирующих подвижность фибробластов.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизацию анализа с использованием миграции фибробластов и FRET-детекции PKA для профилирования эффектов соединений.
- Аналитика: Позволяет получать количественные данные о миграции и передаче сигналов для сравнения генетической или фармакологической модуляции MRP4.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преклиническую преемственность путем установления связи между активностью MRP4 и миграцией фибробластов в моделях, релевантных для восстановления тканей.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для изучения опосредованного транспортера потока циклических нуклеотидов в контекстах миграции и передачи сигналов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает механистическое подтверждение роли MRP4 в миграции через определенные эффекторы (F-actin, PKA) и регуляцию циклическими нуклеотидами.
- Операционная ценность: предоставляет стандартизированные, воспроизводимые методы анализа миграции и визуализации, совместимые с высокопроизводительным скринингом.
- Стратегическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени за счет снижения механистической неопределенности в стромальных фенотипах, связанных с MRP4.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию модуляторов MRP4 с учетом рисков на основе данных о миграции и модуляции путей.
Особенности реализации
- Требуется опыт в проведении иммунопреципитации, масс-спектрометрии и использовании Ingenuity Pathway Analysis для идентификации интерактома.
- Зависимость от наличия инфраструктуры для высококонтентного микроскопирования и использования FRET-биосенсоров для мониторинга активности PKA в режиме реального времени.
- Необходимость проведения стандартизированных анализов миграции фибробластов с использованием планшетов, покрытых фибронектином, и контролируемой модуляции циклических нуклеотидов.
- Необходимость учета адаптационных факторов при применении метода считывания миграции для других типов клеток или стромальных моделей.
- Ограничено необходимостью использования валидированных систем гиперэкспрессии и нокаута MRP4 для изоляции специфических эффектов интерактома и функциональных эффектов.
