Сочетание Double Флуорецсенция В Ситу Гибридизация с Immunolabelling для обнаружения экспрессии трех генов в мышином Срезы мозга

Общая цель этого эксперимента заключается в одновременном обнаружении экспрессии трех различных генов в срезах мозга с использованием двойной флуоресцентной гибридизации in situ с последующим иммуноокрашиванием. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, какой тип клеток выражает интерес к моему гену? Основное преимущество этого метода заключается в том, что вам не нужно хорошее антитело для того, чтобы ваш ген мог локализовать его экспрессию в определенном типе клеток.

Подводя итог этой процедуре, можно сказать, что в первый день неподвижные срезы ткани разрезаются и гибридизуются с помощью двух зондов РНК с разными метками в течение ночи. На второй день срезы инкубируют в течение ночи с антителами, нацеленными на зонд, меченный FETC. Это антитело конъюгировано с пероксидазой хрена, которая катализирует добавление флуоресцентного тирамида на третий день.

Затем конъюгированное антитело щелочной фосфатазы используется для нацеливания на зонд, меченный DIG. На четвертый день этот фермент катализирует образование флуоресцентного осадка при инкубации с раствором Fast Red. Затем срезы инкубируют в течение ночи с первичным антителом, нацеленным на представляющий интерес белок.

Наконец, на пятый день этот белок визуализируется с помощью флуорофора, конъюгированного вторичным антителом. Чтобы начать эту процедуру, выберите клон ДНК, содержащий последовательность кДНК интересующего гена в плазмиде с промоторами РНК-полимеразы. Затем вырастите клон ДНК, извлеките плазмиду с помощью небольшого набора для очистки плазмид и секвенируйте ее с помощью универсальных праймеров T7 и SP6.

Расщепите от 10 до 20 микрограммов плазмидной ДНК с помощью фермента рестрикции, который разрезает пять основных концов чувствительной цепи кДНК. Выдерживайте его в течение 1,5 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем нанесите небольшую аликвоту на агарозный гель, чтобы убедиться, что плазмида полностью линеаризована.

Для очистки линеаризованной плазмиды добавляют 1/10 объема трех моляров ацетата натрия, один объем 10 миллимолярного трис-HCl уравновешенного фенола и один объем изоамилового спирта хлороформа. Центрифугируйте при давлении 16 000 G в течение одной минуты при комнатной температуре и экстрагируйте верхнюю водную фазу. Затем добавьте один объем хлороформа ИУК.

Центрифугируйте его при давлении 16 000 G в течение одной минуты и извлеките верхнюю водную фазу. Повторите этот шаг еще раз. Затем добавьте два объема этанола и держите его при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение одного часа или в течение ночи.

После этого центрифугируйте при 16 000 G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 70% холодным этанолом. Затем повторно суспендировать его в ТЭ в концентрации один микрограмм кДНК на 2,5 микролитра.

Чтобы синтезировать два зонда, сначала выберите подходящую РНК-полимеразу. Затем приготовьте реакцию транскрипции in vitro и доведите конечный объем до 20 микролитров водой, обработанной DEPC. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1,5 часов.

Затем запустите один микролитр транскрипционной реакции на 1%-ный агарозный гель, чтобы проверить, сработала ли реакция. На геле должен быть виден линейный шаблон и яркая полоса зонда. При этой процедуре разрезаются участки замороженной ткани толщиной 15 микрометров в криостате.

Соберите срезы на предметные стекла микроскопа и дайте предметным стеклам высохнуть в течение часа, чтобы убедиться, что ткани прилипли к предметным стеклам. Самым важным фактором для того, чтобы эта процедура работала хорошо, является качество срезов. Это частично зависит от наличия хорошо перфузированной и фиксированной ткани, а частично от техники среза для получения плоских срезов, свободных от загрязнения РНКазой.

Затем разведите два зонда в буфере для гибридизации, предварительно нагретом до 65 градусов Цельсия, и хорошо перемешайте. Нанесите по 300 микролитров гибридизационной смеси на каждую горку и накройте крышкой, запеченной в духовке. Впоследствии инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 65 градусов Цельсия в увлажненной камере.

На следующий день переложите слайды в банку Coplin, содержащую предварительно подогретый буфер для стирки, и промойте слайды в течение 30 минут, дважды, при температуре 65 градусов Цельсия. После этого вымойте слайды в течение 10 минут трижды раствором для стирки MABT комнатной температуры. На этом этапе с помощью гидрофобной ручки нарисуйте круги вокруг участков ткани.

Затем инкубируйте предметные стекла в течение одного часа при комнатной температуре с блокирующим буфером ISH в увлажненной камере. Затем инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия с перекисным конъюгированным антителом против фитк с хреном. Затем поместите предметные стекла в банку с коплином, содержащую PBST.

Промойте их в PBST три раза по 10 минут каждый раз и каждый раз заменяйте свежим PBST. После этого добавьте флуоресцентный тиромид на предметные стекла и оставьте их на 10 минут при комнатной температуре. Поместите предметные стекла в банку с коплином и простирайте в PBST в течение 10 минут три раза.

Затем инкубируйте предметные стекла с блокирующим буфером ISH в течение одного часа при комнатной температуре. Затем инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с конъюгированным антителом против DIG с щелочной фосфатазой. После этого промойте их MABT три раза по 10 минут каждый раз.

Затем дважды промойте предметные стекла 0,1 моляром tris HCL при pH 8,2 в течение пяти минут при комнатной температуре. Отфильтруйте быстрый красный раствор и инкубируйте предметные стекла при температуре 37 градусов Цельсия с быстрым красным раствором во влажной камере. Поскольку время для оптимального развития варьируется, регулярно проверяйте предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы контролировать образование осадка.

Затем промойте их три раза PBST в течение 10 минут каждый раз. Для проведения иммуногистохимии предметные стекла инкубируют с буфером, блокирующим ИГХ, в течение одного часа при комнатной температуре в увлажненной камере. Затем инкубируйте предметные стекла в растворе первичного антитела при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

На следующий день вымойте горки с ПБСТ в течение 10 минут трижды. Инкубируйте их во вторичном растворе антител при комнатной температуре в течение одного часа. Затем промойте их PBST три раза по 10 минут каждый раз.

Затем частично высушите предметные стекла при комнатной температуре и закрепите с помощью флуоресцентной монтажной среды. Дайте предметным стеклам высохнуть, прежде чем получать их изображение в конфокальный микроскоп. Здесь представлены репрезентативные изображения ISH для Aspa и Mbp с последующим иммуноокрашиванием на OLIG2 в сочетании с крючковым окрашиванием.

Aspa экспрессировался в некоторых MBP-положительных OLIG2-положительных клетках в коре и в мозолистом теле. Некоторые Mbp-положительные OLIG2-положительные клетки не экспрессируют Aspa. При выполнении этой процедуры важно помнить, что срезы и все растворы не должны быть загрязнены РНКазой.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изучать паттерны экспрессии генов путем ингибирования N-цитринов и иммуногистохимии. Эта методика может быть адаптирована для различных тканей различного происхождения и стадий развития.