Прогнозирование и проверка элементов гена регуляторной Активированный Во время ретиноевой кислоты индуцированных эмбриональных стволовых дифференцировка клеток

Общая цель этого видео — предоставить интегрированный набор методов для идентификации и экспериментальной валидации генеомных регуляторных элементов, так называемых энхансеров. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы транскрипции и регуляции биологических событий, включая выбор и использование энхансеров, использование дифференцировки клеток или реакцию на внешние стимулы. Основным преимуществом представленного рабочего процесса является то, что протокол может быть легко адаптирован и использован в любых сотовых модельных системах.

Я продемонстрирую этапы процедуры. Для начала выберите потенциальный энхансер на основе уже существующего анализа секвенирования чипов. Используйте браузер генома для просмотра результатов желаемого эксперимента по секвенированию чипов и определения сайтов связывания в непосредственной близости от интересующего гена.

Выберите Define a Region of Interest, чтобы получить последовательность из 200–400 пар оснований выбранной области генома, и используйте эти последовательности для последующего проектирования праймеров. С помощью стандартных методов молекулярной биологии амплифицируйте и клонируйте выбранную область генома в репортерную плазмидную конструкцию. Чтобы проверить активность энхансера, трансфицируйте репортерные конструкции в массовые эмбриональные стволовые клетки, предварительно добавив 200 микролитров 0,1%-ного раствора желатина на лунку в 48 луночных планшетов.

Инкубируйте пластины в течение 30 минут до сервировки. За сутки до трансфекции в пластину не вводят эмбриональный ствол, или ЭС клетки, в 250 мк ЭС среды с плотностью три раза по 10 до четвертой клетки на лунку. В день пересадки приготовьте плазмидные смеси, сделав достаточно для восьми лунок из каждой смеси.

Добавляйте в каждую плазмидную смесь питательную среду с пониженным качеством сыворотки, чтобы довести объем до 106 микролитров. Затем добавьте 4,5 микролитра реагента для трансфекции качества ES и тщательно перемешайте пипетированием 15 раз вверх и вниз. Инкубируйте трансфекционную смесь в течение 15 минут при комнатной температуре.

После инкубации добавьте в клетки по 13 микролитров на лунку трансфекционной смеси и тщательно перемешайте с помощью пипетирования. Затем поместите клетки обратно в инкубатор на ночь перед лечением лишая. Эффективность трансфекции является критически важным этапом.

Если используется другой тип ячеек, то этот шаг требует оптимизации. Используйте наиболее подходящий тип клеток для тестирования активности энхансера, чтобы свести к минимуму эффекты, зависящие от контекста. На следующий день осторожно удалите среду с помощью аспирации и добавьте 250 микролитров свежей среды в лунку, содержащую один микромоляр всей транс-ретиноевой кислоты или ДМСО в качестве носителя.

Инкубируйте клетки в течение 24-48 часов. После приготовления буфера для лизиса в соответствии с текстовым протоколом тщательно отсасывайте среду из клеток. Используйте 1X PBS для подъема клеток один раз, затем добавьте 200 микролитров буфера для лизиса 1X на лунку.

Встряхните клетки при комнатной температуре в течение двух часов. Затем, для полного лизиса клеток, заморозьте лизаты клеток в пластине при температуре 80 градусов Цельсия. После полного размораживания лизатов с помощью электронной многоканальной пипетки передайте 80 микролитров клеточного лизата на 96-луночную прозрачную пластину для бета-галактозидазы и 40 микролитров лизата на белую пластину для измерения люциферазы.

Для проведения бета-галактозидазы смешайте один миллилитр субстратного буфера бета-гал с четырьмя миллиграммами OMPG. Затем добавьте в смесь 3,5 микролитра бета-меркаптоэтанола и сразу же добавьте 100 микролитров буфера к 80 микролитрам клеточного лизата. Инкубируйте реакции при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока не разовьется слабый желтый цвет.

Считайте поглощение на 420 нанометрах на планшетном считывателе и экспортируйте данные. Для проведения анализа люциферазы после подготовки реактива субстрата в соответствии с текстовым протоколом перед началом работы необходимо разогреть реактив субстрата люциферазы до комнатной температуры. Затем нанесите пипетку по 100 микролитров в каждую лунку белой пластины, содержащей 40 микролитров клеточного лизата.

Немедленно используйте люминесцентный счетчик для измерения сигнала. Получите информацию о деятельности по крайней мере из трех независимых трансфекций и экспериментов. Выполните расчеты для обоих анализов в соответствии с текстовым протоколом.

Чтобы разработать праймеры для детектирования эРНК с помощью RTCPR, выберите область генома, которая находится на расстоянии не менее 1,5-2 килограммовых оснований от любых аннотированных транскриптов генов. Определите относительное направление гена и определите положение смысловой и антисмысловой транскриптов. Чтобы разработать праймеры для количественного определения энхансерной РНК, выберите области 200-1000 пар оснований от центра сайта связывания транскрипционного фактора.

Если ген расположен на минусовой цепи, скопируйте 200-300 пар оснований положительной цепи и преобразуйте последовательность, чтобы получить последовательность обратного комплемента. Затем используйте эту последовательность для последующего проектирования грунтовки. Установите диапазон размеров продукта в диапазоне от 80 до 150 пар оснований.

Чтобы измерить транскрипцию эРНК, после выделения общей РНК из обработанных клеток в соответствии с текстовым протоколом, обнаружить обратную транскрибированную эРНК с помощью RTCPR с помощью стандартной процедуры. Измерьте мРНК, не зависящую от лечения, для нормализации. Как показано здесь, биоинформатический анализ данных секвенирования чипа RXR, полученных из ES-клеток, обработанных ретиноевой кислотой, выявил обогащение половины ядерного рецептора под занятыми RXR участками.

С помощью биоинформатического алгоритма результаты поиска мотивов для половины участка были сопоставлены с данными последовательности чипа RXR. Этот анализ идентифицировал наложение пиков чипов на канонические сайты связывания ядерных рецепторов. Визуализация сайтов в IGV показала обогащение транскрипционных факторов, близких к Hoxa1.

Ранее охарактеризованная мишень RAR RXR. Также был идентифицирован карательный усилитель для новой цепи-мишени РА, PRMT8. Идентифицированные области энхансера клонировали в репортерный вектор TK люциферазы, и ЭС-клетки трансфицировали этими конструкциями.

Активность люциферазы определяли при отсутствии и присутствии РА. Конструкции, содержащие элемент ответа на РА, или RARE, показали повышенную интенсивность сигнала люциферазы при лечении РА, в то время как конструкция без RARE не индуцировалась. Чтобы установить, коррелирует ли смысловая и антисмысловая экспрессия эРНК связанного энхансера Hoxa1 RAR RXR с экспрессией мРНК гена, также был измерен уровень эРНК Hoxa1. Результаты подтвердили, что активность энхансера индуцируется краткосрочным лечением РА.

После освоения этой рабочей нагрузки можно выполнить за несколько дней, проведя описанный эксперимент с ловушкой энхансера и количественное определение энхансера, можно получить убедительные функциональные доказательства активности энхансера. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выявлять и характеризовать карательные усилители. После того, как энхансер идентифицирован и валидирован, могут быть применены другие методы, такие как захват хромосомного подтверждения или CCC, чтобы ответить на дополнительные важные вопросы, например, какой ген регулируется валидированным энхансером?