Одновременная оценка кардиомиоцитов синтеза ДНК и плоидности: метод для оказания помощи квантификации кардиомиоцитов регенерации и оборота

Общая цель этого протокола заключается в количественной оценке оборота кардиомиоцитов с использованием долгосрочного нуклеозидного мечения и проточной цитометрии для количественной оценки ядер неокардиомиоцитов с учетом полиплоидизации ядер. Этот метод может быть использован для решения ключевых вопросов в области регенерации кардиомиоцитов и может быть использован в качестве скринингового инструмента для количественной оценки изменений в динамике генерации кардиомиоцитов. Основным преимуществом этого протокола является то, что он позволяет проводить чувствительную и точную количественную оценку образования неокардиомиоцитов, независимо от клеточного источника и контролируя полиплоидацию.

Через 24 часа после шестой инъекции EdU поместите пролеченное животное в положение лежа на спине и с помощью хирургических ножниц сделайте разрез кожи от середины живота до диафрагмы. Далее придерживая грудину подальше от полости тела, двусторонне разрежьте диафрагму, чтобы обнажить сердце. Затем слегка приподнимите сердце и перережьте основные кровеносные сосуды выходного тракта, чтобы отделить сердце от грудной полости.

Сразу после сбора поместите сердца в отдельные центрифужные пробирки объемом 15 мл, содержащие 10 мл PBS, охлажденного до четырех градусов Цельсия. Затем переложите образцы в отдельные 10-сантиметровые чашки Петри и с помощью скальпеля разрежьте каждое сердце на две части в сагиттальной ориентации. Далее аккуратно сожмите кусочки сердца с помощью щипцов.

Удалите оба кусочка сердца и поместите их в чашку Петри, содержащую 20 мл свежего PBS. Повторите еще раз с новой чашкой Петри и 20 мл свежего PBS. Поместите обе части сердца в одну и ту же микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и с помощью иглы 25 калибра проделайте небольшое отверстие в крышке каждой пробирки, чтобы предотвратить открытие крышки после обработки сердца.

Затем промаркируйте каждую пробирку и заморозьте сердечные ткани в емкости с жидким азотом. Для каждого сердца, которое необходимо проанализировать, инкубируйте 36 мл однопроцентного BSA и PBS в ультрацентрифужной пробирке. Выбросьте раствор через 30 минут.

Когда пробирки высохнут на воздухе, добавьте в каждую пробирку по 10 мл градиентного раствора сахарозы. После индивидуального измельчения образцов сердца, замороженных жидким азотом, с помощью скальпеля, перенесите фрагменты ткани из каждого сердца в отдельные конические пробирки объемом 50 мл, содержащие 15 мл буфера для лизиса клеток. Гомогенизируйте образцы в течение 15 секунд при 25 000 об/мин с помощью зондового гомогенизатора при комнатной температуре.

Затем добавьте еще 15 мл буфера для лизиса в каждую пробирку и переносите образцы по одному в 40 мл с помощью пестика с большим клиренсом. Выполните 10 взмахов пестиком и отфильтруйте клеточные суспензии через сетчатый фильтр 100 микрон, а затем через клеточный фильтр 40 микрон в отдельные центрифужные пробирки объемом 50 мл. Затем соберите ядерные сердечные гранулы центрифугированием и повторно суспендируйте клетки в 25 мл градиентного раствора сахарозы каждая.

Нанесите слой клеток поверх градиента сахарозы без ядер в подготовленные ультрацентрифужные пробирки и центрифугируйте слои с помощью ротора откидной трубки. После центрифугирования суспендируйте гранулы ядер в 1 300 микролитрах буфера для хранения ядер и перенесите ядра в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, помеченную PCM1. Перелейте по 300 микролитров каждой суспензии из пробирок PCM1 в новую микроцентрифужную пробирку и добавьте 700 микролитров буфера для хранения свежих ядер и пометьте ISO control.

Затем пометьте ядра PCM1 антителом против PCM1, а контрольные ядра ISO — быстрым антителом для контроля изотипа IGG в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день открутите образцы и повторно суспендируйте гранулы в одном мл буфера для хранения свежих ядер для повторного центрифугирования в тех же условиях. После второго спина ресуспендируйте гранулы в одном мл буфера для хранения свежих ядер и инкубируйте ядра с одним микролитром фитзи конъюгированного фрагмента F(ab'2 козьего антитела против бешенства IGG в течение одного часа при четырех градусах Цельсия в темноте.

Для оценки степени включения EdU центрифугируйте РСМ1 и ISO контрольные ядра суспензий и ресуспендируйте гранулы в одном мл 1% БСА PBS два раза в течение двух последовательных промывок. После второй промывки замените надосадочную жидкость на 100 микролитров фиксатора EdU и инкубируйте образцы в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. В конце фиксации ядра еще два раза промыть в одном мл PBS BSA, затем инкубировать образцы со 100 микролитрами раствора для пермеабляции на основе сапонинов при комнатной температуре.

Через 15 минут добавьте в каждую пробирку 500 микролитров свежеприготовленного коктейля с маркировкой EdU для 30-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации прокрутите образцы три раза, промывая ядра в одном мл PBS BSA во время вторых двух центрифугирований. Наконец, пометьте образцы 400 микролитрами раствора для окрашивания ДНК.

Иммуногистологический анализ пульсирующих сердец демонстрирует наличие PCM1-экспрессирующих кардиомиоцитов, которые включают EdU. Тем не менее, данные, полученные с помощью иммуногистологических методов, могут быть неверно интерпретированы, поскольку другие типы клеток, включающие EdU, могут быть ошибочно идентифицированы как кардиомиоциты. При исследовании мышей mdx и контрольной мыши, анализ проточной цитометрии, подробно описанный в этом протоколе, позволяет быстро количественно оценить генерацию ядра неокардиомиоцитов, а также исключить клетки, которые включили EdU в деполиплоидизацию.

Как и в случае с ранее опубликованными данными, в этом репрезентативном эксперименте наблюдалось увеличение скорости генерации ядер неокардиомиоцитов в сердцах мышей mdx по сравнению с контрольной группой, сопоставимой по возрасту. После освоения этой техники ее можно освоить за четыре часа в течение двух дней. При выполнении этой процедуры важно помнить об отрицательных элементах управления EdU и PCM1, чтобы стробы могли быть точно установлены во время анализа.

Этот метод также совместим с рядом дополнительных иммуногистологических методов, позволяющих количественно оценить включение нуклеоцитов в ряд различных типов сердечных клеток. Этот метод был использован в области сердечно-сосудистых исследований для изучения изменений в регенерации кардиомиоцитов в mdx-модели неишемической кардиомиопатии. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как быстро количественно определить ядра неокардиомиоцитов, следить за подсчетом полиплоидации для скрининга изменений в регенерации и обороте кардиомиоцитов.