Foraging Протокол Путь длиной для Дрозофилы личинки

Общая цель этого анализа состоит в том, чтобы количественно оценить локомоторный компонент поведения личинок дрозофилы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генетики поведения о генетическом и экологическом вкладе в индивидуальные различия в поведении личинок. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он быстрый, воспроизводимый и позволяет собирать образцы большого размера.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что успех анализа зависит от времени развития и последовательного, осторожного обращения с подопытными животными. Демонстрировать процедуру будут Ина Анрайтер и Оскар Васкес, аспиранты моей лаборатории. Подготовьте бутылку для хранения, вырезав отверстия на одной стороне пластиковой бутылки для выращивания мух весом шесть унций.

Далее с помощью шприца наполните крышки чаши Петри заранее приготовленной средой виноградного сока до тех пор, пока поверхность среды виноградного сока не образует купол над краем крышки. Храните виноградные пластины во влажном и герметичном контейнере при температуре четыре градуса Цельсия до двух недель. В чашки Петри размером 100 на 15 миллиметров насыпьте заранее приготовленный корм от мух.

Приобретите три черные плексигласовые пластины с десятью круглыми лунками диаметром десять сантиметров, расположенными в форме два на пять, чтобы проверить личинок, и черный разбрасыватель из плексигласа, используемый для нанесения дрожжевой пасты на плексигласовые пластины. Затем отделите крышки от дна посуды Петри. Соберите от 100 до 150 самок и от 50 до 75 самцов.

Позвольте самкам и самцам спариваться на ночь в бутылке для разведения мух на шесть унций со стандартным кормом для мух. Переложите мух в бутылку для удержания и с помощью малярного скотча закрепите виноградную пластину с небольшим количеством свежей дрожжевой пасты над верхней частью бутылки. Оставьте бутылку стоять вверх дном, а тарелку с виноградом на дне, чтобы взрослые могли отложить яйца на тарелку с виноградом.

Выбросьте первую виноградную тарелку через 24 часа и поместите новую виноградную тарелку в бутылку для хранения. Через 22 часа выньте виноградные пластины из бутылок и поместите их в чашку Петри размером 60 на 15 миллиметров. Далее поставьте новую виноградную тарелку со свежей дрожжевой пастой на бутылку для хранения.

Очистите и выбросьте всех личинок с виноградной пластины с косточками с помощью препарирующего щупа. Инкубируйте очищенные виноградные пластины в течение четырех часов в стандартных условиях. Через четыре часа соберите 100 личинок L1, или личинок первого возраста, с каждого сорта с виноградных пластин и положите их на тарелки с едой.

Размещайте личинок на корме аккуратно, не прокалывая корм и не закапывая личинок. Группы из десяти личинок могут быть выбраны и размещены за один раз. Избегайте скученности, распределив личинок по тарелке с едой.

Инкубируйте пищевые тарелки до тех пор, пока подопытные животные не окажутся за десять часов до начала кочевок, когда личинки покидают пищу в поисках места окукливания. Если личинки начали бродить и передвигаются по крышке чашки Петри, как вы можете видеть здесь, животные слишком стары для тестирования, и время их развития должно быть пересмотрено. Растворите дрожжи в воде в соотношении один к двум.

Следите за тем, чтобы готовая паста капала и оставляла на поверхности пасты ленты, которые быстро тают. Оценка правильной консистенции дрожжевой пасты более важна, чем использование точного соотношения, из-за вариативности между брендами, партиями дрожжей и окружающей средой. С помощью кисточки аккуратно вытащите личинок из пищевой тарелки от первого штамма.

Соберите личинок в чашку Петри и аккуратно промойте личинок водой, чтобы удалить всю пищу. Быстро промойте личинки двумя миллилитрами воды и аккуратно промокните личинки насухо лабораторной салфеткой. Держите личинок во влажной среде, но не погружайте в воду, чтобы избежать стресса.

Расположите три тестовые пластины рядом друг с другом и установите пятиминутный таймер для каждой тестовой пластины. Нанесите дрожжевую пасту на верхнюю часть тестовых пластин и с помощью разбрасывателя распределите тонкий слой дрожжевой пасты на каждой тестовой пластине так, чтобы во всех лунках был равномерный слой дрожжей. Аккуратно поместите по одной личинке в центр каждой лунки.

Запускайте пятиминутный таймер сразу после размещения первых личинок на каждой тарелке. Затем поместите остальных личинок в оставшиеся лунки. Сверху на каждую лунку накройте крышкой чашку Петри.

Когда таймер истечет, начните отслеживать длину пути, оставленную в дрожжах, с помощью перманентного маркера, не удаляя личинок из пластины. Траектории следов длиной в том же порядке и с той же скоростью, что и личинки, были размещены на пластинах. Наконец, повторите шаги теста длины пути личинки для каждого штамма.

Данные, собранные в течение трех дней тестирования подряд, показали значительный эффект деформации, когда марсоходы путешествовали дальше, чем сидячие. В дополнение к эффекту деформации, личинки, которые были лишены пищи в течение четырех часов до тестирования, имели значительно меньшую длину пути, чем личинки, которых кормили. В целом, длина пути была больше, когда оба штамма выращивались на пище с высоким содержанием питательных веществ, по сравнению с пищей с низким содержанием питательных веществ.

При правильном выполнении этот анализ позволяет одному человеку с легкостью протестировать до 500 личинок за четыре часа, что делает его ценным для крупномасштабного фенотипирования. Следуя процедуре, которую мы только что показали, можно проверить другие переменные, такие как пол, недостаток пищи или качество пищи, чтобы показать влияние этих переменных на модели движения, связанные с пищей. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как измерить пищевую локомоцию личинок дрозофилы для оценки генетического и экологического вклада в индивидуальные различия в поведении.