Intra-подвздошной артерией Инъекции для эффективного и селективного моделирования Микроскопическое костными метастазами
26 сентября 2016 г.
В этой рукописи подробно описана процедура инъекции внутриподвздошной артерии (IIA), техника доставки раковых клеток конкретно в ткани задних конечностей, включая кости, для установления экспериментальных метастазов в кости. Несмотря на то, что первоначально этот протокол был разработан для моделей опухолей молочной железы, его можно легко распространить на другие типы рака.
Общая цель этой процедуры заключается в установлении экспериментального метастазирования в кости путем доставки раковых клеток непосредственно в ткани задних конечностей, включая кости, путем внутриподвздошной артерии. Таким образом, этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы о колонизации костей раком молочной железы, особенно на ранней стадии этого процесса, о том, как клетки рака молочной железы взаимодействуют с клетками микроокружения в кости. Сегодня мы сделали инъекцию в подвздошную артерию.
Основное преимущество этого метода заключается в том, что он эффективно и избирательно создает экспериментальную микроскопическую модель метастазов в кости для различных типов рака, не вызывая локального повреждения тканей. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что для поиска инъекции, которая была бы точной, положение для инъекции подвздошной артерии на микроскопе, может потребоваться практика для достижения более чем девяноста процентов успеха инъекции. Начните с подтверждения соответствующего уровня седативного эффекта, ущипнув палец ноги двадцатиграммовой мыши в возрасте от пяти до шести недель.
После нанесения глазной мази протрите выбритую область правого паха несколько раз последовательными, стерильными, пропитанными на 70% изопропилэтанолом ватными тампонами, после чего нанесите хирургический скраб бетадином. Далее накройте всю мышь стерильной простыней. Затем с помощью стерильного лезвия скальпеля из углеродистой стали номер десять и рукоятки номер три сделайте разрез кожи от одного до 1,2 сантиметра между четвертым и пятым сосками в нижней правой части живота.
И перенести животное под стандартный настольный диссекционный микроскоп. Под объективом 4X введите тупые разделительные щипцы в разрез между жировой тканью и брюшиной и вытолкните ткани наружу с обеих сторон, чтобы открыть подвздошные сосуды и нервы. Затем с помощью прямых тонких щипцов прорвите соединительную ткань между сосудами и ближайшим к сосудам нервом.
Затем проведите угловыми щипцами через соединительную ткань и под подвздошными сосудами, одновременно вводя прямые щипцы в соединительные ткани с другой стороны сосудов, чтобы направить наклонные щипцы через ткань. Для этого этапа мы рекомендуем отделить и подтянуть подвздошный ободок и артерию в виде пучка. Хотя опухолевые клетки вводятся только в артерию, это экономит время и усилия для изоляции обоих сосудов вместе.
После того, как угловые щипцы будут на месте, дополнительно отделите подвздошную вену и артерию от окружающих тканей, удерживая сосуды поверх угловых щипцов во время рассечения. Когда сосуды очистятся, с помощью прямых щипцов поднесите кончик шелкового шва 4-0 к наклонным щипцам и медленно и осторожно протяните шов под сосудами. Затем обе подвздошные общие вены и сосуды артерий должны быть зажаты швом.
Когда сосуды будут готовы, несколько раз пипетируйте опухолевые клетки вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать их в одноклеточный раствор и разбить любые комки. Затем аспирируйте 100 микролитров клеток каждой мыши в инсулиновый шприц 31 калибра. Теперь сдвиньте наклонные щипцы обратно под сосуды, используя шов в качестве ориентира, и откройте щипцы так, чтобы сосуды мягко лежали на кончиках.
Другой рукой введите кончик иглы скошенной стороной вверх в просвет участка артерии между кончиками щипцов. Медленно нажмите на поршень, чтобы ввести клетки. Клеточная суспензия будет вымывать кровь по сосуду.
Когда все клетки будут доставлены, аккуратно извлеките иглу, удерживая сосуды приподнятыми на щипцах, чтобы предотвратить кровотечение. Затем оттяните шов. Наконец, быстро снимите щипцы и прижмите ватный тампон к разрезу на пять-10 минут, чтобы остановить кровотечение.
Здесь показано репрезентативное биолюминесцентное изображение цельного животного после инъекции в подвздошную артерию пять раз по 10 до пятой части меченых GFP люциферином клеток рака молочной железы MCF-7 с последующим введением d-люциферина путем инъекции ретроорбитального синуса. На 14-е сутки после инъекции был получен сильный сигнал биолюминесценции от интраподвздошной артерии, инъецируемой задней кости, но не от контралатеральной контрольной кости, что подтвердило специфическую локализацию введенных клеток. Секционирование H&E окрашивания опухолевидных костей также продемонстрировало компактную, булыжную популяцию клеток с большими ядрами, указывающими на микроскопические метастатические поражения MCF-7 в костной ткани через 14 дней после инъекции внутриподвздошной артерии.
Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание костных срезов также выявило совместное смешение клеток MCF-7 с остеобластами и преостеобластами. После освоения этой техники ее можно освоить за десять-пятнадцать минут. Следуя этим процедурам, вы можете использовать другие методы для ответа на дополнительные вопросы.
Например, мы можем использовать RNA-Seq для профилирования клеток микроокружения в нише метастазирования и сравнения их с нормальными клетками. Этот метод предоставляет исследователям рака молочной железы и рака предстательной железы один из способов изучения микрометастазов в кости у животных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как установить модель метастазирования рака молочной железы в кости с помощью инъекции внутриподвздошной артерии.
Пожалуйста, примите соответствующие меры предосторожности, поскольку работа с кетамином и ксилазином может быть чрезвычайно опасной.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной рукописи подробно описывается методика инъекции в внутреннюю подвздошную артерию (IIA) для доставки раковых клеток в ткани задних конечностей, включая кости, с целью создания экспериментальных метастазов в костной ткани. Этот метод особенно полезен для изучения взаимодействия клеток рака молочной железы с микроокружением кости.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Онкология
- Экспериментальные методы
Теоретическая часть
- Метастазирование в кости является распространенным осложнением у онкологических больных.
- Понимание механизмов колонизации раковых клеток в костной ткани имеет решающее значение для разработки методов терапии.
- Метод инъекции в внутреннюю подвздошную артерию обеспечивает направленную доставку раковых клеток.
- Данная методика минимизирует повреждение местных тканей по сравнению с другими способами.
Цель исследования
- Создание модели для изучения метастазирования в кости.
- Исследование взаимодействий между клетками рака молочной железы и клетками костного микроокружения.
- Повышение точности и эффективности техники инъекции.
Используемые методы
- Внутриподвздошная инъекция раковых клеток.
- Использование модели мышей в возрасте от пяти до шести недель.
- Мониторинг уровня седации с помощью щипкового теста за пальцы лап.
- Отработка техники инъекций для достижения высокого процента успеха.
Основные результаты
- Данный метод позволяет эффективно создавать модели метастазов в костной ткани.
- При наличии соответствующего опыта можно достичь высоких показателей успеха.
- При использовании этого метода наблюдается минимальное повреждение местных тканей.
- Получаются сведения о ранних фазах колонизации клетками рака молочной железы.
Выводы
- Инъекция в внутреннюю подвздошную артерию является ценным инструментом для исследования рака.
- Данный метод может быть адаптирован для различных типов рака, помимо рака молочной железы.
- Дальнейшие исследования могут углубить понимание взаимодействий между раковыми клетками и костной тканью.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Создание надежных моделей метастазирования в кости на ранних стадиях остается критически важной задачей при разработке онкологических препаратов, особенно для оценки терапевтического воздействия на колонизацию микрометастазов. Метод инъекции в внутреннюю подвздошную артерию обеспечивает пространственно и временно синхронизированное распространение раковых клеток в кости задних конечностей, что позволяет проводить точный количественный анализ диссеминированных опухолевых клеток и снижает влияние побочных воспалительных реакций, вызванных процедурным повреждением тканей. Такой подход повышает прогностическую достоверность доклинических исследований, позволяя осуществлять непрерывный мониторинг инертных костных поражений без развития системных метастазов в органы, что улучшает трансляционную значимость моделей метастазов в кости для валидации мишеней и поиска перспективных соединений-лидеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем моделирования ранних взаимодействий раковых клеток с компонентами микроокружения кости, такими как остеобласты и преостеобласты.
- Практическая ценность: обеспечивает селективный и эффективный способ доставки раковых клеток в кости задних конечностей, что способствует стабильному созданию моделей во всех экспериментальных когортах.
- Стратегическая ценность: способствует механистическому снижению рисков при изучении путей костного метастазирования, позволяя визуализировать прогрессирование микрометастазов от одиночных клеток до многоклеточных очагов с помощью биолюминесцентного и гистологического анализа.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели, такие как интенсивность биолюминесцентного сигнала и плотность гистологических очагов поражения, что обеспечивает стандартизированную оценку метастатической нагрузки.
- Операционная ценность: исключает повреждение местных тканей и связанные с этим искажающие факторы заживления ран, что повышает воспроизводимость анализа и снижает вариабельность в последующих исследованиях.
- Стратегическая ценность: позволяет создавать биологические системы, релевантные заболеванию, с минимальным метастазированием в другие органы, что обеспечивает более длительные окна наблюдения для изучения зависимости «доза-эффект» и временных характеристик в рамках скрининговых кампаний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует системам, релевантным для изучения заболевания, за счет фиксации процесса перехода от диссеминированных опухолевых клеток к микрометастазам в костной ткани, что является ключевым клиническим барьером.
- Операционная ценность: Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, поддерживая возможность проведения лонгитюдной визуализации и анализа конечных точек, таких как окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и иммунофлуоресцентное окрашивание.
- Стратегическая ценность: Помогает принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении препаратов, предоставляя ранние сигналы эффективности соединений, которые нарушают взаимодействие раковых клеток со стромой или формирование ниш в микроокружении костной ткани.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Метод инъекции в внутреннюю подвздошную артерию вписывается в континуум разработки — от валидации мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинических испытаний эффективности, особенно для препаратов, направленных на костную ткань, где моделирование раннего метастазирования позволяет изучить механизмы заболевания и определить терапевтические окна.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о взаимодействии раковых клеток с микроокружением кости, обеспечивая контролируемую доставку опухолевых клеток в скелетные участки.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу биологические системы с количественными биолюминесцентными и гистопатологическими показателями, подходящими для платформ высокопроизводительного скрининга.
- Аналитика: позволяет получать измеримые зависимые переменные, включая поток фотонов при биолюминесценции, площадь поражения на гистологических срезах и индексы колокализации опухолевых и стромальных клеток.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преклиническую преемственность путем моделирования аваскулярной микрометастатической фазы, которая предшествует остеолитической или остеобластической прогрессии при клиническом метастазировании в кости.
- Применение в организациях: представляет собой стандартизированную хирургическую методику, адаптируемую для различных типов рака и лабораторий, что способствует единообразию между проектами при создании моделей метастазирования в кости.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения шума, вызванного процедуционным воспалением, и обеспечения четкой привязки фенотипических изменений к механизмам действия препарата.
- Операционная ценность: Повышает уровень стандартизации и воспроизводимости благодаря определенным анатомическим ориентирам и изоляции сосудов с помощью направляющих швов, что минимизирует вариабельность, зависящую от оператора.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет получения ранних показателей метастазирования в конкретных органах, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях из-за непредвиденного тропизма к костной ткани.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации кандидатов, нацеленных на костную ткань, с учетом рисков, позволяя проводить прямое сравнение степени метастатической нагрузки в различных группах терапии в сингенных моделях или моделях ксенотрансплантатов.
Особенности реализации
- Требуется владение методами микрохирургии, включая изоляцию сосудов и наложение лигатур при использовании диссекционного микроскопа.
- Необходим доступ к стерильным диссекционным микроскопам, тонким пинцетам, инсулиновым шприцам и оборудованию для приготовления изотонической клеточной суспензии.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов анестезии (например, кетамин/ксилазин) и послеоперационного мониторинга для обеспечения благополучия животных и воспроизводимости модели.
- При адаптации метода следует учитывать необходимость корректировки объема инъекции и концентрации клеток в зависимости от агрессивности линии раковых клеток и вариабельности штамма мышей.
- Практические ограничения включают период обучения для достижения показателя успешности инъекций >90%, а также необходимость соблюдения правил асептики для предотвращения загрязнения брюшной полости при разрезе в паховой области.
