ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (HL115578 А. Макино).

Исследования на мышах было одобрено животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) из Университета штата Аризона и по проводили в соответствии с Национальным институтом здоровья (NIH) руководящих принципов. Примечание: В разделах 1, 2 и 3 следует проводить за день до начала эксперимента в качестве установки. 1. приготовления растворов <ol><li> CD31 буфер (50 мл) <ol><li> Добавить 50 мл 1 × забуференного физраствора (PBS) в 50 мл пробирку. Взвешивают 0,05 г бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,037 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и добавляют к 50 мл трубку и положить трубку, чтобы вращаться в течение приблизительно 1 ч до порошка не растворится. Регулировка рН до 7,4, фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 мкм в новую 50 мл пробирку, и хранят при температуре 4 ° С до использования. </li></ol></li><li> Ханка сбалансированный солевой раствор (HBSS) с HEPES (500 мл) <ol><li> Добавьте 1.1915 г HEPES сделать 10 мМ HEPES в растворе HBSS и хорошо перемешать. Измерьте рН и отрегулировать до 7,4. Фильтр и хранить при температуре 4˚C. </li></ol></li><li> раствор 1x Кребса (1 л) <ol><li> Добавляют 100 мл раствора 10 × Кребса [Таблица 1] в дважды дистиллированной воде в колбу емкостью 1 л. Взвешивают 2,1 г бикарбоната натрия и 2 г D-глюкозы и добавляют в колбу. Смешать и довести общий объем до 1 л </li><li> Bubble раствор с 95% O 2/5% CO 2 газа в течение 30 мин и фильтровальной раствора внутри капота. Хранить при температуре 4 ° С и держать на льду во время эксперимента. </li></ol></li></ol> 2. Подготовка магнитных шариков <ol><li> Добавляют 1 мл CD31 буфера в каждую 1,5 мл трубки (одна трубка на образец). Смешайте овец против крысиного IgG шарики и добавить соответствующее количество для каждого образца [Таблица 1]. Встряхнуть пробирки энергично 30 раз и поместить их в магнитной пластине в течение 1 мин встряхивания. Откройте трубки в то время как на пластине и складывать решения в ведро. </li><li> Добавить 1 мл CD31 буфера в каждую пробирку. Добавьте 2 мкл анти-мышиных анти CD31тела в каждую пробирку и вращать трубы O / N при 4 ° С. </li></ol> 3. автоклавирования <ol><li> Автоклав все инструменты хирургии и пипеток. Обрежьте концы пипеток, так что есть наконечники с 4-х различных диаметров, от самой широкой до узкой. Приблизительные диаметры для наконечников 3 мм, 2,5 мм, 2 мм и 1,5 мм соответственно. Обрежьте кончики и автоклав за день до 30 мин стерилизации при температуре 121 ° С. Примечание: Разделы 4 - 11 должны проводиться на день эксперимента. </li></ol> 4. Решения Готовимся <ol><li> Приготовьте промывочный буфер, содержащий 2% обогащенные железом телячьей сыворотки (МФХБ) в M199. Для получения изображений, подготовить 30 мл / мышь. </li><li> Готовят раствор фермента (10 мл / образец). Взвешивают 0,6 ед / мл диспаза и 1 мг / мл коллагеназы типа II в 50 мл пробирку. Добавить M199 и вращать трубу при температуре 4 ° С в течение 15 мин. Смесь фильтруют через фильтр 0,2 мкм в новую 50 мл трубки insidе капот и держать при температуре 4 ° С до использования. </li><li> Приготовьте HBSS / HEPES с гепарином. Добавьте 10 мл HBSS с 10 мМ HEPES в 15 мл пробирку. Добавьте 100 мкл гепарин в пробирку и хранить при температуре 4 ° С до использования. </li></ol> 5. Стиральная Бусы <ol><li> Выньте пробирки с бусинами из ротатора при 4 ° С и привести к капоту. Место труб в магнитной пластины и встряхивают в течение 1 мин. Свалка раствора и добавляют 1 мл буфера CD31 в каждую пробирку. </li><li> Возьмите трубы из магнитной пластины и энергично встряхивают в 30 раз. Поместите трубки обратно в магнитной пластины и повторить в общей сложности 3 стирок. После завершения, поместите пробирки обратно в 4С и держать вращая до использования. </li></ol> 6. Вскрытие <ol><li> Впрыскивать мышей внутрибрюшинно 0,1 мл гепарин для предотвращения свертывания крови. Подождите 10 минут, а затем обезболить мышей с использованием внутрибрюшинную инъекцию 0,01 мл пентобарбитала. Проверьте, если мышь чувствуетболи, зажимая ногу. </li><li> Поместите мышь на полистирольной доске с головы и держать руки иголками. Используйте пинцет и жесткие-CUT-ножницы, чтобы разрезать кожу на верхней грудной области до горла. </li><li> Делают разрез в центре грудной клетки, как раз над диафрагмой. Вырежьте кость в сторону и вверх по направлению к горлу, чтобы сделать треугольник, раскрывающую сердце и легкие. Вырезать аорту чуть выше диафрагмы. </li><li> Держите тимус с пинцетом, не вытаскивая и использовать ножницы, чтобы тщательно вырезать любой соединительной ткани, чтобы удалить легкие и сердце вместе. Место ткани в химическом стакане с 1 × Кребса, трясти с пинцетом и передать 6 см блюдо с 1 × Кребса. </li><li> Удалите долей легких с помощью ножниц и щипцов. Вставьте 20 G стерильный катетер в аорту. Промойте кровь в коронарной системы кровообращения с HBSS / гепарин. Сделайте небольшой разрез в желудочке, трясти сердце и переносят в пробирку из M199. Хранить трубы на льду. </li></ol><p<html> класс = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. Ткань Переваривание <ol><li> Перенести сердце на 6 см чашку, наполненную 10 мл раствора фермента и фарша его на мелкие кусочки с помощью ножниц. Поместите посуду в 37 ºC инкубаторе в течение 15 мин. Перемешайте переваривается материалы пипетированием вверх и вниз 30 раз через наконечник с конца разреза, чтобы ткань, чтобы пройти через легче. </li><li> Положите его обратно в 37 ºC инкубаторе в течение еще 15 мин. Повторите агитацию в три раза, каждый раз с помощью пипеток из самых больших отверстий в узком и 15 мин инкубации между собой. </li><li> После последней 15-минутной инкубации, берут пробы, и в капот. Пипеткой решение вверх и вниз 30 раз, используя пипеткой наконечник с отверстием и узкому проходят через 40 мкм клеточный фильтр с в новый 50 мл пробирку. </li><li> Мойте блюдо с буфером для промывки 10 мл с помощью 10 мл пипетки и переносят на клеточный фильтр. Поместите 50 мл пробирки в центрифуге и спина при 400 г в течение 10 мин при комнатной температуре. </li></ol>Заголовка &quot;&gt; 8. Стирка и Сопряжение с бисером <ol><li> Удалить супернатант, не нарушая гранул. Вымойте клеток с буфером для промывки 5 мл дважды. </li><li> Получить один из предварительно приготовленный 1,5 мл пробирки с бисером и работы на одной трубе одновременно. Положите одну 1,5 мл трубки в магнитной пластине, встряхнуть 3 раза и открыть его. </li><li> После последнего центрифугирования, удалить как можно больше супернатант насколько это возможно, не нарушая гранул. Разъединить сгустки клеток Смахивающее энергично. </li><li> Добавить 1 мл промывочного буфера в 50 мл пробирку и смешать клетки с 1 мл пипетки. Дамп раствора из 1,5 мл трубки и прибавляют 1 мл клеточной суспензии из 50 мл пробирку с гранулами. Флик трубок 30 раз затем, вращая при 4 ° С в течение 30 мин. </li></ol> 9. Подготовка к клеточной культуре / визуализации <ol><li> Подготовка камеры для металлизации ячеек. Добавить раствор желатина (5% вес / объем, 300 мкл) в камере и для покрытия поверхности и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С. После инкубации РЗМОве желатин и сухой поверхности. </li><li> Выньте пробирки с бисером / клеток через 30 мин вращения и положить в магнитной пластины внутри вытяжки. Встряхивают в течение 2 мин, свалка и добавьте 1 мл промывочного буфера. </li><li> Возьмите трубы из пластины, энергично встряхивают 30 раз, то Флик в 30 раз. Положите их обратно в магнитную пластину и встряхивают в течение 1 мин. Повторить 4 раза в общей сложности 5 промываний, но с 1 мин встряхивая на тарелке. </li><li> После последней промывки, вынуть одну трубку и работать на каждой трубке по одному за раз. Взболтать 30 раз затем вылить в 30 раз. Положите его на магнитную пластину и встряхивают в течение 1 мин. Свалка и добавить 1 мл 20% СМИ МФХБ EC (предварительно нагревают при 37 ° С). </li><li> Энергично встряхивают 30 раз затем вылить в 30 раз. Отрегулируйте пипетку до 500 мкл и пипеткой вверх и вниз 10 раз. Перенести 500 мкл в каждую камеру. </li><li> Помещенный при 37 ºC инкубатора и оставить O / N. На следующий день, мыть клетки с 10% FBS СМИ ЕС. </li></ol> 10. Подготовка к вестерн-блот (ВБ) Образцы <ol><li> Takе из пробирки с бисером / клеток через 1 ч вращения. Поместите их в магнитную пластину и встряхивают в течение 2 мин. Свалка супернатант и добавляют 1 мл холодного HBSS. Энергично встряхивают 30 раз затем вылить в 30 раз. Повторите дважды в течение 3 стирок, но с 1 мин встряхивая на тарелке. </li><li> После последней промывки, положить трубы на магнитной пластине и встряхивают в течение 1 мин. Удалить буфер с помощью пипетки и лизиса клеток для WB с использованием метода ранее описанного 11,12. Собранная лизат обычно содержит около 30 мкг белка. </li></ol> 11. обработки изображений <ol><li> Промыть клетки 3 раза с помощью средств массовой информации, с конечным объемом 250 мкл для камеры. Добавить 1,5 мкл Dil-AcLDL к клеткам. С этой точки зрения, сохранить клетки в темноте. </li><li> Инкубируют в течение 3,5 ч при 37 ° С. Добавить 1,5 мкл Hoechst, хорошо перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при 37 ˚C.Wash клеток с PBS и зафиксировать 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре. </li><li> Промыть два раза с PBS и блокируют с 5% BSA-PBS в течение 30 мип при комнатной температуре. Промыть два раза с 1% BSA-PBS. Развести BS-лектин-FITC с использованием 1% BSA-PBS, до концентрации 2 мкг / мл и добавляют по 300 мкл в каждую камеру. </li><li> Поместите камеру на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Мытье с PBS 3 раза. </li><li> Визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом с временем экспозиции 200 мс для FITC (лектина окрашивания, с маркером ЕС, возбуждение / излучения 488 нм / 519 нм), 30 мс для DAPI (Hoechst, ядерное окрашивание, возбуждения / эмиссии при 358 нм / 461 нм), и 300 мс для TRITC (AcLDL окрашивания, с маркером ЕС, возбуждения / эмиссии при 557 нм / 576 нм). Получение изображений с использованием 20X объектив. </li></ol>

<ol><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell functions.</a> J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).</li>
<li>Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+focus%3A+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells in focus: endothelial cell.</a> Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91, 3527-3561 (1998).</li>
<li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%3A+testing+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance.</a> Circulation. 115, 1285-1295 (2007).</li>
<li>Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+vascular+endothelial+cells+from+murine+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung.</a> Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).</li>
<li>Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+connexin40+is+associated+with+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev Cell. 26, 204-219 (2013).</li>
<li>Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+pulmonary+endothelial+cells+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAcase+overexpression+reverses+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+type+1+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).</li>
<li>Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC%3A+old+protein+with+new+roles+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">VDAC: old protein with new roles in diabetes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Наиболее широко используемые эндотелиальные клетки в исследовании являются эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs) из-за их удобства и простоты культивирования. Тем не менее, много исследований требует наличия физиологической модели достигается за счет выделения эндотелиальных клеток от других конкретных органов 10. Эндотелиальные клетки составляют очень незначительную популяцию клеток в ткани сердца; их изоляция и культивирование может оказаться очень трудным. Есть ...

Мышиные модели различных сердечно-сосудистых заболеваний и нарушений обмена веществ несут физиологические и молекулярные изменения, которые аналогичны тем, которые встречаются у пациентов. Кроме того, генетическое изменение мышей является мощным инструментом, который позволяет исследовать патогенную роль специфических генов в развитии и прогрессировании заболеваний. В настоящее время, ген-забивные камерного типа специфических или отъезда мышей легко образуются во многих лабораториях и измерения мРНК и уровня белка в определенных типах клеток является первым шагом в определении того, мыши были действительно генетически модифицированы. Эндотелий представляет собой тонкий один слой эндотелиальных клеток (ЭКС), что линии внутренней стенки сосуда. Эндотелиальные клетки играют важную роль в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости сосудов, а также новые сосудистые образования 1,2. Эндотелиальная дисфункция является отличительной чертой многих патологических состояний и изменений в эндотелиальной функции может привести к различным автомобилясосудистых заболеваний 3,4. Таким образом, существенным для изучения функции эндотелиальных клеток в физиологических и патофизиологических условиях. Есть несколько способов , чтобы изолировать ECs 5-8 и метод изоляции должен быть оптимизирован в зависимости от того, который будет использоваться тканей и видов. Это происходит потому , что КЭ из разных тканей показывают высокий уровень неоднородности по отношению к их поверхности маркеров и экспрессии белка 9. Успешное выделение эндотелиальных клеток часто может быть сложным и требует некоторой степени обучения и практики. После того, как достигнуто, способ выделения предложенного в данном протоколе оказывается стабильной и эффективной. Общая цель этого метода является получение мыши коронарных (MCECs ECs) высокого качества и количества. Даже при том, что количество клеток, выделенных из сердца меньше, чем клетки, собранные из других тканей с использованием других методов, этот метод все еще обеспечивает ставкуКачество тер. Чистота эндотелиальных клеток в результате популяции превышает 90%. Таким образом, этот метод был бы идеальным для приложений, которые опираются на чисто изолированных эндотелиальных клетках, таких как клетки визуализации.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>SH3026801</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Бикарбонат натрия&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-глюкоза&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads сковорода для мыши IgG beads&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Антитело к мышам CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>IFCS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>SH30072.04</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Диспаза Fisher</td><td>MT10060-CV</td><td></td></tr><tr><td>(нейтральная протеаза)</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS02109</td><td></td></tr><tr><td>коллагеназа типа II&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>глицерин&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021-50 мл</td><td></td></tr><tr><td>Коктейль ингибиторов фосфатазы</td><td>Sigma</td><td>P0044-1 мл</td><td></td></tr><tr><td>Коктейль ингибиторов протеазы</td><td>Sigma</td><td>P8340-1 мл</td><td></td></tr><tr><td>Гепарин&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>D-Valine</td><td>Sigma</td><td>V1255-5G</td><td></td></tr><tr><td>EGS</td><td>Corning</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>пенициллин/стрептомицин</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

Выделение мыши ишемическая эндотелиальных клеток

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Эндотелиальные клетки выстилают внутреннюю стенку кровеносных сосудов и играют важную роль в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости сосудов и новой сосудистой формации. Эндотелиальной дисфункции клеток вовлечена в развитие и прогрессирование многих сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе ишемической болезни сердца. Для изучения функции и характеристики коронарных эндотелиальных клеток, клеток изоляции является первым шагом, и это требует высокой степени чистоты и количества для проведения последующих экспериментов. Этот протокол описывает эффективный метод, чтобы изолировать взрослых мышей коронарные эндотелиальные клетки. Сердце мыши рассекают и измельчали ​​на мелкие кусочки. После того, как переваривание сердца с помощью диспазу и коллагеназы II, клетки промывали и инкубировали с магнитными шариками, которые сопрягаются с анти-CD31 антителом. Шарики с эндотелиальные клетки промывают несколько раз и готовы к использованию в различных приложениях, в том числе изображений и молекулярно-биологической experimeNTS. Эффективная изоляция дает приблизительно 10 4 клеток на одно сердце с чистотой более 90%.

Успешное выделение коронарных эндотелиальных клеток из сердца мыши обычно дает около 10 4 клеток с более чем 90% чистоты с помощью формы булыжник. Для получения чистой популяции эндотелиальных клеток, следует соблюдать осторожность в течение всего протокола для обеспечения стерильной среде, свободной от каких-либо загрязнений. Появление удлиненных клеток или увеличенных клеток в популяции указывает на загрязнение с другими типами клеток, клеток и фибробластов гладкой мускулату...

Этот протокол подготовлен для того, чтобы поделиться нашим методом выделения коронарных эндотелиальных клеток мышей с целью визуализации или проведения молекулярно-биологических экспериментов.

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Общая цель данного эксперимента — получение большого количества высокоочищенных высококачественных эндотелиальных клеток коронарных артерий мыши. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области сердечно-сосудистых исследований. Основным преимуществом данной методики является обеспечение высокого выхода качественных эндотелиальных клеток.Эту процедуру продемонстрируют специалист по исследованиям Шичжэнь Ло и доктор Аяко Макино, наш главный исследователь. За одну неделю до начала процедуры добавьте 1 mL буфера CD31 в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 mL для каждого образца. Затем аккуратно перемешайте суспензию магнитных частиц с антителами против IgG овцы с помощью дозатора и добавьте соответствующий объем частиц в каждую пробирку.После добавления всех бусин энергично встряхните пробирки 30 раз и поместите их на магнитную платформу для встряхивания в течение одной минуты. Затем, не снимая пробирок с платформы, удалите буфер и добавьте в каждую пробирку один миллилитр свежего буфера CD31. Добавьте два микролитра меченых антител к CD31 мыши и поместите пробирки на ротатор при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.На следующий день перенесите пробирки в ламинарный шкаф и снова поместите их на магнитную платформу с перемешиванием в течение одной минуты. Затем замените супернатант одним миллилитром свежего буфера CD31 и энергично встряхните пробирки вручную 30 раз. После третьей промывки верните пробирки в ротатор при температуре четырех градусов Цельсия.В день проведения процедуры начните с внутрибрюшинного введения экспериментальному животному 0.1 milliliters гепарина для предотвращения свертывания крови. Через десять минут проведите анестезию мыши, введя 0.01 milliliters пентобарбитала. Затем убедитесь в отсутствии реакции на щипок за палец.После совместного извлечения сердца и легочной ткани поместите их в стакан с буфером Кребса и промойте ткани при осторожном встряхивании. Затем перенесите ткани в чашку диаметром шесть сантиметров со свежим раствором Кребса и с помощью ножниц и пинцета удалите доли легких. Теперь введите катетер 20 G в аорту и промойте коронарную систему кровообращения раствором HBSS с добавлением гепарина.После полного удаления крови сделайте небольшой надрез в желудочке, промойте сердце, осторожно встряхивая его, и поместите сердечную ткань в пробирку с образцом на льду. После переваривания ткани для высвобождения эндотелиальных клеток коронарных сосудов осадите клетки центрифугированием и дважды промойте их пятью миллилитрами промывочного буфера. Затем поместите пробирку с предварительно подготовленными магнитными частицами на магнитную платформу и встряхните пробирку три раза для равномерного распределения частиц.После второй промывки удалите как можно больше супернатанта, не повреждая осадок, и ресуспендируйте клетки, интенсивно постукивая по пробирке. Затем аккуратно перемешав, ресуспендируйте клетки в 1 mL промывочного буфера и удалите буфер CD31 с магнитных частиц. Объедините клетки с частицами и постучите по пробирке 30 раз.Затем поместите смесь клеток и бусин на ротатор при температуре 4 °C на 30 минут. Пока клетки инкубируются, покройте поверхность одной лунки посевной камеры для каждого образца раствором желатина и выдержите камеры при 37 °C в течение 30 минут. После затвердевания желатина удалите излишки раствора геля и просушите поверхность лунки камеры.Затем перенесите клетки, конъюгированные с магнитными частицами, на магнитную платформу под вытяжной шкаф и подвергните перемешиванию в течение двух минут, после чего слейте промывочный буфер. Добавьте к клеткам 1 mL свежего промывочного буфера, снимите пробирку с платформы и интенсивно встряхните ее 30 раз, затем 30 раз резко постучите по дну пробирки. Верните пробирку на платформу еще на одну минуту перемешивания.После последнего перемешивания верните пробирку на магнитную платформу для окончательного встряхивания в течение одной минуты, затем замените промывочный буфер одним миллилитром среды для эндотелиальных клеток при 37 °C, дополненной 20% сыворотки теленка, обогащенной железом. Встряхните и щелкните пробирками еще 30 раз. Затем с помощью дозатора на один миллилитр, установленного на 500 µL, перемешайте конъюгированные клетки десять раз и перенесите аликвоты коронарных эндотелиальных клеток объемом 500 µL в каждую лунку посевной камеры для инкубации в течение ночи при 37 °C.На следующий день промойте клетки средой для эндотелиальных клеток, дополненной 10% FBS. Чистоту коронарных эндотелиальных клеток, выделенных этим методом, можно подтвердить с помощью иммуногистохимического окрашивания на маркеры поверхности эндотелиальных клеток — BS-лектин и AC-LDL; при этом в типичной культуре коронарных эндотелиальных клеток мыши более 90% клеток демонстрируют двойную положительную экспрессию обоих маркеров. После выполнения данной процедуры в качестве метода могут быть проведены различные анализы крови, иммунорецепции и флуоресцентная визуализация для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, о том, какие белки могут модифицироваться при различных патологических состояниях.После разработки этот метод предоставляет исследователям инструменты, необходимые для расширения их изысканий в области изучения эндотелиальных клеток коронарных артерий. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделить эндотелиальные клетки коронарных артерий мыши в достаточном количестве и с высоким качеством. В данной процедуре есть несколько ключевых моментов.Самым важным аспектом является поддержание стерильности среды на протяжении всего процесса изоляции. Во-вторых, необходимо полностью и как можно быстрее промыть сосуды от крови, чтобы избежать коагуляции крови в капиллярной сети. В-третьих, следует измерить pH всех буферов, особенно буфера CD31.

isolation-of-mouse-coronary-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Здесь мы опишем протокол для изоляции и культуре мышиных легочных эндотелиальных клеток. Этот метод включает в себя механические и ферментативной диссоциации легочной ткани, а также 2-х ступенчатый процесс очистки с использованием анти-PECAM-1 и анти-ICAM-2 антител, конъюгированных с магнитных бус, который производит чистый эндотелиальной клеточной популяции в основном микрососудистых происхождения.

Выделение и культуре эндотелиальных клеток легочной от новорожденных мышей

Способность выделять эндотелиальные клетки сердечного клапана (VECs) имеет решающее значение для понимания механизмов развития, поддержания и заболевания клапанов.  Здесь мы описываем выделение VEC от эмбриональных и взрослых мышей Tie2-GFP с помощью FACS, что позволит провести исследования, определяющие вклад VECs в процессы развития и заболевания.

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Эндотелиальные клетки сосудов играют важную роль во многих важных сердечно-сосудистых заболеваниях. В этой статье описан простой метод выделения и расширения эндотелиальных клеток из аорты мыши без использования какого-либо специального оборудования. Наш протокол предоставляет эффективные средства выявления механизмов в физиопатологии эндотелиальных клеток.

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

Целью данного протокола является демонстрация техники Выделение и культивирование мышиных первичных клеток гладких мышц сосудов (VSMCs) от коронарного кровообращения. После того, как VSMCs были изолированы, они могут быть использованы для многих стандартных методов культуры.

Выделение мышиной коронарных сосудов клетках гладкой мускулатуры

Микроваскулярная эндотелиальных клеток скелетных мышц (MMEC) форма внутренней стенки капилляров мышц и регулировать так, обмен жидкости/молекул и миграции клеток (иммунитет) между мышечной ткани и крови. Изоляция первичного мышиных MMEC, как описано здесь, позволяет всеобъемлющего в пробирке исследования группы «myovascular».

Изоляция микрососудистой эндотелиальных клеток первичного мышиных скелетных мышц

Мы представляем протокол для изоляции эндокардиальных и коронарных эндотелиальных клеток от крысиных сердец через последовательное пищеварение ткани в буфере пищеварения, сбор клеток от периодических циклов центрифуги, и очистка клеток с использованием анти-крысы CD31 микробусы.

Изоляция эндокардиальных и коронарных эндотелиальных клеток от вентрикулярной свободной стены Крысиного Сердца

Здесь мы описываем и демонстрируем протокол первичной изоляции синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши (LSEC). Протокол основан на перфузии коллагеназы печени, непаренхимальной очистке клеток низкоскоростной центрифугированием и выборе магнитных шариков CD146. Мы также фенотипируем и характеризуем эти изолированные ЛСЭК с помощью проточной цитометрии и сканирующей электронной микроскопии.

Выделение и характеристика первичных синусоидальных эндотелиальных клеток печени мыши

Представлен метод выделения эндотелиальных клеток и ядер из просвета сонных артерий мышей, подвергающихся воздействию стабильных или нарушенных условий течения для проведения экспериментов с одноклеточной омикой.

Выделение эндотелиальных клеток из просвета сонных артерий мыши для одноклеточных мультиомных экспериментов

В этой статье первичные эндотелиальные клетки легких были выделены и культивированы у новорожденных мышей.

Выделение первичных эндотелиальных клеток легких мыши

Этот протокол описывает выделение эндотелиальных клеток мыши из целой поджелудочной железы.

Выделение эндотелиальных клеток поджелудочной железы мыши

Узнайте метод выделения коронарных эндотелиальных клеток мыши для исследований сердечно-сосудистой системы. Этот протокол обеспечивает высокий выход чистых клеток, пригодных для молекулярно-биологических экспериментов.

Выделение мыши ишемическая эндотелиальных клеток

Больше видео