Руководство по Structured Illumination TIRF микроскопией на высокой скорости с несколькими цветами
30 мая 2016 г.
Эта статья представляет собой подробное руководство по сборке и эксплуатации микроскопа со структурированным освещением, работающего с флуоресцентным освещением с полным внутренним отражением (TIRF-SIM), для изображения динамических биологических процессов с оптическим сверхразрешением в нескольких цветах.
Общая цель этого протокола заключается в создании и выравнивании структурированного светового микроскопа, подходящего для высокоскоростной визуализации живых клеток со сверхвысоким разрешением, способного работать в режимах TIRF и оптического среза с несколькими цветами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, на которые в настоящее время невозможно ответить с помощью стандартной дифракционно-ограниченной микроскопии TIRF. Основным преимуществом этого метода является его быстрое временное разрешение по сравнению с другими методами микроскопии со сверхвысоким разрешением, что делает его хорошо подходящим для визуализации динамических процессов в живых клетках.
Несмотря на то, что этот протокол описывает этапы создания микроскопа TIRF-SIM, его конфигурация является гибкой и легко модифицируется для реализации таких методов визуализации, как 3D-SIM, мультифокальная SIM и нелинейная SIM. Чтобы упорядочить и выровнять путь возбуждения для микроскопа структурированного освещения, начните с обозначения положения компонентов на оптическом столе, как показано здесь. После вставки первого дихроичного зеркала, DM4, в фильтровальную кубическую турель рамы микроскопа, вставьте второе дихроичное зеркало, DM3, в квадратное кинематическое зеркало размером в один дюйм и расположите его на расстоянии одного фокусного расстояния от конденсорной линзы L5. Далее, чтобы точно определить оптический доступ к системе, снимите линзу объектива (OB) с револьверной головки и вместо нее вкрутите инструмент для юстировки.
Затем используйте дихроичное зеркало DM3 и временное юстировочное зеркало, расположенное в приблизительном конечном положении SLM, чтобы направить коллимированный референсный луч от первого лазера через центр отверстий в двух юстировочных дисках. Используя три зеркала и дихроичное зеркало DM2, как показано здесь, направьте луч от лазерного к временному зеркалу. После определения грубой оптической оси снимите инструмент для юстировки.
Затем вставьте диафрагму в траекторию луча до того, как она войдет в корпус микроскопа, и центрируйте ее на луче. Прикрепите кусок белого картона с небольшим отверстием по центру радужной оболочки, затем снова вставьте линзу объектива. Далее произведите итерационные угловые корректировки зеркал DM3, и в положении SLM отцентрируйте обратное отражение на карте с входящим лучом.
Затем временно снимите линзу объектива и отметьте лазерное пятно на потолке, чтобы создать опорное положение. Вставьте тубусную линзу L5 примерно на одно фокусное расстояние от объектива и установите ее на столик для линейного перемещения, настроенный на перемещение вдоль направления опорного луча. Отрегулируйте положение и угол линзы тубуса таким образом, чтобы луч, выходящий из объектива, коллимировался и попадал в точку отсчета на потолке.
Убедитесь, что линза находится перпендикулярно лучу, еще раз проверив обратное отражение с диафрагмой и белой картой. Затем снимите линзу объектива и вставьте вторую линзу ретранслятора изображения телескопа, L4. Используйте столик линейного перемещения, чтобы отрегулировать положение и угол наклона этой линзы, чтобы сохранить коллимацию и убедиться, что опорный луч по-прежнему попадает в отмеченное место на потолке. Установите на место линзу объектива и вставьте первую линзу телескопа, L3. Отрегулируйте положение и угол наклона этой линзы, чтобы обеспечить коллимацию и отсутствие отклонения, как описано ранее.
После установки микросхемы SLM в соответствии с текстовым протоколом, с юстировкой линз, вставьте микросхему SLM на место зеркала. Отрегулируйте положение SLM таким образом, чтобы опорный луч располагался в центре микросхемы SLM, и отрегулируйте угол так, чтобы луч проходил через две линзы реле. Затем убедитесь, что опорный луч по-прежнему центрирован в отмеченном месте.
Установите жидкокристаллический переменный замедлитель (LCVR) так, чтобы его быстрая ось находилась под углом 45 градусов к падающей поляризации. Затем после завершения юстировки поляризационного вращателя по текстовому протоколу, используя проходящий через окуляры свет, сфокусироваться на прицельной сетке и зафиксировать линзу объектива в этом положении. Затем приготовьте монослой из флуоресцентных шариков, распределив каплю 100 нанометров многоцветных бусин на покровное стекло под номером 1,5.
Дайте бусинам высохнуть, чтобы они прилипли к стеклу, прежде чем снова погрузить в воду. Используя иммерсионное масло, поместите образец шарика на объектив. Точно отрегулируйте положение камеры так, чтобы слой флуоресцентных шариков был в фокусе.
После создания шаблонов двоичной решетки SIM в виде файлов растровых изображений и загрузки их в SLM в соответствии с текстовым протоколом, загрузите управляющее программное обеспечение SLM и нажмите кнопку «Подключить». Во вкладке «Репертуар» нажмите «Загрузить», чтобы открыть файл репертуара, и проверьте количество выполняемых заказов, содержащихся в файле. Нажмите «Отправить на доску», чтобы загрузить файл репертуара в SLM.
Далее выбираем вкладку «Статус» и вводим номер текущего заказа. Нажмите кнопку "Выбрать", чтобы изменить порядок выполнения на юстировочной решетке. Вставьте пространственную маску, или SM, установленную на XY-столике, в траекторию луча в фокальной позиции L3 и переместите ее положение относительно оптической оси таким образом, чтобы были переданы только нужные первые приказы.
Сразу после пространственного фильтра будут видны только два круглых луча. Проверьте изображение слоя флуоресцентных шариков на камере. Если два круглых луча не перекрываются, как показано здесь, измените положение плоскости образца, итеративно регулируя объектив и положение камеры.
После тонкой настройки фокусировки и установки плоскости образца в соответствии с текстовым протоколом подтвердите освещение TIRF путем визуализации, например, раствора 10 микромолярного красителя родамина 6G, подведя краситель в фокус. Если два луча падают под правильным углом TIRF, то отдельные молекулы будут видны без высокого фона, а края круглой апертуры будут в фокусе. Тонкая регулировка положения лучей может быть выполнена с помощью регулировки дихроичного зеркала DM3.
Чтобы синхронизировать и откалибровать систему, поместите образец монослоя шарика на объектив и сфокусируйтесь. Используйте управляющее программное обеспечение SLM, чтобы запрограммировать SLM на отображение каждого из трех изображений фазового сдвига по очереди для первой ориентации шаблона. Затем переключитесь на четвертый порядок из примера репертуара.
В программном обеспечении для сбора данных настройте камеру для глобального периода экспозиции, выбрав «Расширенные свойства камеры» и установив для параметра «Тип выходного триггера 1» положительное значение, а для параметра «Тип выходного триггера 2» — отрицательное. В области последовательности в разделе Тип сканирования выберите Запись на жестком диске и установите количество кадров равным трем. Затем нажмите «Пуск», чтобы получить три кадра.
Шаблон SLM будет меняться при каждой экспозиции. После вызова системы в соответствии с текстовым протоколом в управляющем программном обеспечении SLM переключите порядок выполнения SLM на полную серию из девяти изображений двоичной решетки, необходимых для TIRF-SIM. Это нулевой порядок в репертуаре примера.
После получения девяти изображений образца валика на панели последовательности программного обеспечения камеры выберите тип сканирования «Запись на жестком диске» и измените количество кадров на девять. Затем нажмите «Начать», чтобы получить изображения. Наконец, в разделе «Сохранить буферизованные изображения» выберите тип изображения TIFF и нажмите OK. Реконструируйте изображение в сверхвысоком разрешении в соответствии с текстовым протоколом.
На рисунке показаны многоцветные флуоресцентные шарики диаметром 100 нанометров для сравнения стандартных TIRF и TIRF-SIM. TIRF-SIM явно имела значительно более высокое боковое разрешение по сравнению с TIRF. Расчетное разрешение микроскопа составляет 90 нанометров и 120 нанометров для 488 и 640 нанометров TIRF-SIM соответственно.
Это соответствует двукратному улучшению бокового разрешения для обеих длин волн по сравнению с теоретическим случаем, ограниченным дифристанцией. Как видно на рисунке, флуоресцентно меченые амилоидные фибриллы были сформированы in vitro и также использовались в качестве тестового образца для демонстрации удвоенного разрешения. Субклеточные структуры с высокой контрастностью, такие как меченые emGFP микротрубочки или LifeAct-GFP, идеально подходят для визуализации TIRF-SIM и позволяют получать изображения с высокой контрастностью и сверхвысоким разрешением.
Визуализация TIRF-SIM с использованием продемонстрированной установки позволяет наблюдать за субпопуляцией микротрубочек, расположенных в непосредственной близости от коры базальных клеток, а также наблюдать полимеризацию и деполимеризацию микротрубочек с течением времени. Низкоконтрастные образцы без дискретных структур не имеют информации с высоким разрешением, за исключением краев плазматической мембраны, и, следовательно, являются неоптимальными для визуализации TIRF-SIM. Наконец, высокая контрастность модуляции имеет важное значение для успешной визуализации SIM-карты.
Как показано на рисунке, преобразование Фурье восстановленного изображения позволяет визуализировать оптическую передаточную функцию SIM. После освоения этой техники она может быть завершена примерно за одну неделю, если все необходимые детали уже приобретены. При попытке выполнить эту процедуру необходимо знать о наиболее важных вопросах для успешного внедрения TIRF-SIM.
Во-первых, важное значение имеет точное выравнивание лучей. Это может быть затруднительно, так как они должны располагаться по краям диафрагмы объектива. Во-вторых, очень важно, чтобы поляризационное состояние света вращалось вместе с рисунком.
Без этого контрастность образца будет низкой, и последующее построение изображения будет невозможно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о наиболее важных этапах создания и юстировки микроскопа TIRF-SIM на основе SLM. Не забывайте, что работа с лазерами класса 3B может быть чрезвычайно опасной.
Мощность лазера должна поддерживаться на безопасном для глаз уровне во время выполнения процесса юстировки с установленным объективом TIRF.
Обзор
В данной статье представлено подробное руководство по сборке и юстировке микроскопа структурированного освещения для высокоскоростной суперразрешающей визуализации живых клеток с использованием TIRF-SIM. Этот метод эффективен для визуализации динамических биологических процессов в нескольких цветах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Методы микроскопии
- Изображения сверхвысокого разрешения
Теоретические основы
- Стандартная TIRF-микроскопия имеет ограничения в разрешении динамических процессов.
- Методы сверхразрешения расширяют возможности визуализации.
- Микроскопия структурированного освещения (SIM) обеспечивает более высокое временное разрешение.
- Данный протокол позволяет гибко модифицировать конфигурацию микроскопа.
Цель исследования
- Сконструировать микроскоп TIRF-SIM для проведения высокоточного имиджинга.
- Обеспечить возможность изучения биологических процессов, требующих высокого временного разрешения.
- Предоставить подробный протокол для воспроизведения данной установки другими исследователями.
Используемые методы
- Юстировка оптических компонентов, включая дихроичные зеркала и линзы.
- Использование жидкокристаллического фазового модуля (вариатора задержки) для контроля поляризации.
- Подготовка образцов флуоресцентных микросфер для калибровки.
- Внедрение программного обеспечения для управления SLM с целью генерации паттернов.
Основные результаты
- Успешная юстировка микроскопа TIRF-SIM.
- Демонстрация возможностей визуализации с использованием флуоресцентных микросфер.
- Проверка условий TIRF-освещения.
- Разработка протокола для последующих исследований по визуализации.
Выводы
- Установка TIRF-SIM позволяет осуществлять высокоскоростную визуализацию динамических процессов.
- Этот метод позволяет решать вопросы клеточной биологии, которые ранее были недоступны.
- Гибкость установки обеспечивает возможность использования различных модальностей визуализации.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высокоскоростная многоцветная визуализация со сверхразрешением отвечает потребности в визуализации динамических процессов в анализах на живых клетках, позволяя снизить механистические риски при выборе терапевтических мишеней за счет прямого наблюдения за субклеточной динамикой. TIRF-SIM обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени, позволяя с временной точностью разрешать наноразмерные белковые взаимодействия и события трафика, что поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки на ранних этапах поиска. Эта возможность расширяет развитие методов анализа для фенотипического скрининга, предоставляя количественные, пространственно разрешенные данные, которые повышают уверенность в выборе мишени и снижают количество ложноположительных результатов при идентификации ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации локализации и динамики белков в живых клетках с разрешением 90–120 nm.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством прямого наблюдения полимеризации и деполимеризации микротрубочек вблизи базального кортекса.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность исследований взаимодействия с мишенями за счет разрешения субпопуляций микротрубочек и амилоидных фибрилл с двукратным увеличением латерального разрешения по сравнению с дифракционным пределом.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем калибровки с использованием монослоев флуоресцентных микросфер для установления эталонных показателей разрешения.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет синхронизированной генерации паттернов SLM, контроля длины волны и управления спуском камеры для стабильного захвата кадров.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для различных длин волн возбуждения (488 nm, 640 nm) и режимов визуализации, включая TIRF и режимы оптического секционирования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: позволяет связать результаты исследований субклеточных структур (например, микротрубочек emGFP, LifeAct-GFP) с доклинической валидацией посредством высококонтрастной визуализации со сверхвысоким разрешением.
- Продвижение с учетом рисков: способствует снижению механистических рисков путем визуализации динамических процессов в живых клетках, которые не видны при стандартной TIRF-микроскопии, что помогает при выборе мишеней.
- Система, релевантная заболеванию: демонстрирует применимость к моделям на живых клетках, поддерживая согласование биомаркеров для таких процессов, как динамика микротрубочек при нейродегенерации или раке.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод применяется на этапе от начального поиска до идентификации соединений-лидеров, когда наноразрешение динамических процессов позволяет подтвердить валидность мишени и готовность анализа к скринингу соединений.
- Фундаментальная биология: Оказывает поддержку в проверке гипотез и выяснении путей передачи сигналов за счет визуализации распределения и динамики белков в наномасштабе в моделях живых клеток.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа благодаря количественной высокочастотной визуализации (до 10 Hz) с возможностью многоцветного окрашивания для надежной оценки соединений.
- Аналитика: Предоставляет статистические данные посредством реконструированных изображений сверхвысокого разрешения и валидации оптической передаточной функции на основе преобразования Фурье для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями посредством визуализации субклеточных структур, имеющих значение для патологии, с высоким контрастом и разрешением.
- Корпоративное использование: Позволяет использовать систему как универсальный инструмент для различных модальностей визуализации (TIRF-SIM, 3D-SIM, мультифокальный SIM) в рамках различных проектов.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: прогностическая достоверность, валидация мишени, снижение механистической неопределенности при визуализации живых клеток.
- Операционная ценность: стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость за счет автоматизированного контроля поляризации, пространственной структуры и синхронизации длин волн.
- Стратегическая ценность: более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах благодаря ранней визуализации динамики мишеней.
- Влияние на портфель: приоритезация с учетом рисков и принятие решений о продвижении препаратов на основе прямого наблюдения за поведением терапевтической мишени в физиологически релевантных условиях.
Особенности реализации
- Требуются знания в области юстировки оптики, лазерной безопасности (класс 3B) и генерации паттернов на базе SLM для структурированного освещения.
- Необходим инструментарий для контроля поляризации (жидкокристаллический переменный фазовращатель), триггеров высокоскоростной камеры и интеграции многоволновых лазеров.
- Требуется межкомандная стандартизация настройки оптического стола, позиционирования компонентов и протоколов калибровки с использованием монослоев флуоресцентных микросфер.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных типов образцов, так как образцы с низким контрастом не обладают информацией высокого разрешения, за исключением краев мембран.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость высокого контраста модуляции для успешного SIM-визуализирования и точной юстировки пучка в апертурах объектива.
