Подготовка 3D Коллаген Гели и микроканалов для изучения 3D взаимодействий В Vivo

Общая цель этой процедуры заключается в создании выровненных и случайных 3D-коллагеновых матриц с целью наблюдения за миграцией клеток или другими клеточными процессами в контексте 3D-среды. Этот метод предназначен для улавливания особенностей коллагена, которые мы находим в реальных тканях, что может помочь ответить на ключевые вопросы, такие как механизмы, которые клетки используют для распознавания выровненного или случайного внеклеточного матрикса. Основное преимущество этого метода заключается в том, что вы можете манипулировать организацией 3D-среды, отображать ячейки внутри и вы можете сделать это экономически эффективно с помощью оборудования, которое является общедоступным.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что они недостаточно хорошо смешивают раствор коллагена и нейтрализующий буфер и непоследовательно втягивают коллаген через каналы. Демонстрировать эту процедуру будет Брайан Беркель, старший научный сотрудник моей лаборатории. Для начала тщательно перемешайте коллаген и буфер HEPES перед добавлением клеток и среды, чтобы обеспечить надлежащую нейтрализацию коллагена.

Затем добавьте клетки и среду в нейтрализованную смесь коллагена и положите ее на лед, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Пипеткой нанесите ледяную смесь на стерильную поверхность, не обработанную тканевой культурой, чтобы свести к минимуму прикрепление и рост клеток за пределами коллагенового геля. С помощью пипетки равномерно распределите раствор.

Дайте гелю полимеризоваться при комнатной температуре в течение примерно 10-15 минут. Затем накройте гели крышкой и переместите их в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия еще на 45-60 минут, чтобы завершить полимеризацию. После полимеризации гель станет непрозрачным.

После полимеризации добавьте два-три миллилитра среды. Затем выпустите гели со стенок лунки, проведя пипеткой 200 по периметру лунки. Осторожно покрутите посуду, чтобы выпустить гель с нижней поверхности.

С целью создания PDMS микроканалы для выравнивания коллагеновых матриц. Сначала подготовьте мастер-мастер из кремния SuA, используя стандартные методы мягкой литографии, описанные в другом месте. Затем с помощью крафт-палочки тщательно перемешайте 20 граммов эластомерной основы с 2 граммами отвердителя в одноразовом стаканчике.

После хорошей перемешивания дегазируйте смесь PDMS, поместив одноразовый стаканчик в вакуумную камеру под вакуумным давлением 550 миллиметров ртутного столба. Дегазируйте смесь примерно от одного до полутора часов. Во время дегазации PDMS подготовьте силиконовый мастер, поместив чистый лист прозрачной пленки на горячую пластину, а затем кремниевый мастер.

Убедитесь, что форма для микроканалов направлена вверх. Через один-полтора часа удалите дегазированный PDMS из вакуумной камеры. Медленно насыпьте PDMS в центр мастера и позвольте силе тяжести равномерно распределить его.

Далее аккуратно скатайте второй лист прозрачной пленки поверх силиконового мастера и PDMS, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Аккуратно положите резиновый лист поверх прозрачного материала, затем лист акрила толщиной 1/8 дюйма, затем добавьте первый из трех десятифунтовых грузов поверх акрилового листа. Первоначально первый груз будет плавать, позволит ему осесть и стабилизироваться, прежде чем приступить к работе с двумя оставшимися весовыми пластинами.

Когда вы будете готовы продолжить, установите горячую плиту на 70 градусов Цельсия и отверждайте PDMS в течение четырех часов. После отверждения дайте PDMS остыть в течение как минимум одного дополнительного часа, а затем осторожно снимите верхнюю прозрачную пленку для пластины. Наконец, удалите каналы с помощью щипцов.

Поместите каналы вверх дном на новую чистую прозрачную пленку и очистите все порты круговыми движениями острых щипцов. Удалите все отслоившиеся фрагменты PDMS. Далее приложите кусок упаковочной ленты к скамейке липкой стороной вверх и установите канал PDMS стороной вниз поверх ленты.

Надавите на каналы круглым концом пары щипцов, чтобы обеспечить хороший контакт. Удалите каналы и повторяйте этот процесс с обеих сторон, пока не будет удален весь видимый мусор. Затем перенесите чистые, подготовленные каналы PDMS в 50-миллилитровую коническую трубку, заполненную 70% этанолом.

Закрутите каналы на максимальной скорости в течение 30 секунд, а затем замените раствор на свежий, 70% этанол. Используя асептические методы, переложите канал PDMS стороной вверх в чистую и стерильную посуду. Затем УФ-излучением обрабатывайте каналы до тех пор, пока этанол не испарится.

После высыхания переверните каналы на крышку или стеклянную форму со стеклянным дном и прижмите их к стеклу, чтобы обеспечить хорошее уплотнение. Добавьте участок стерильного PDMS, чтобы покрыть и закрыть центральную часть каналов, и дайте установке полностью высохнуть, прежде чем продолжить. Затем поместите каплю 100 микролитров раствора коллагена со скоростью 10 микрограммов на миллилитр на верхнюю часть канала и проведите ее через канал с помощью вакуума.

Инкубируйте каналы при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, а затем перенесите каналы, еще заполненные раствором коллагенового покрытия, в холодильник. Охладите установку в течение примерно 15–30 минут, а затем с помощью аспиратора или пипетки удалите раствор коллагенового покрытия из каналов. Начните с нейтрализации коллагенового раствора, разбавив его клеточными средами и инкубируя на льду в течение 15 минут.

Затем поместите от 120 до 150 микролитров коллагенового раствора в порт А предварительно охлажденного канала. Затем подсоедините пипетку объемом 25 миллилитров к вакуумной линии и поместите ее над портом C. Используйте ее для втягивания смеси одним равномерным движением, останавливаясь, как только коллаген достигнет конца. Самым важным шагом к созданию случайных матриц является медленное протягивание коллагена через канал.

Если он прорисовывается слишком быстро, это приведет к увеличению выравнивания в части канала или по всему каналу. Осторожно удалите излишки раствора из областей порта, а затем поместите стерильные пластыри PDMS на оба порта, А и С. Через две-три минуты снимите центральный пластырь PDMS, закрывающий порт В, и добавьте два-три микролитра клеток в концентрации от одного до трех миллионов клеток на миллилитр в центральный порт. Дайте гелю время частично полимеризоваться при комнатной температуре еще от 10 до 15 минут, а затем перенесите препарат в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия еще на 15-30 минут.

После полимеризации снимите крышки портов PDMS и добавьте фильтрующий материал, чтобы полностью закрыть канал. Здесь 50 000 четырех Т-1 клеток были помещены либо в коллагеновый гель в дозе 2 мг/мл, либо в 3,5 мг/мл в течение 5 дней. Линия с четырьмя Т-клетками является высокосократительной линией Med Aesthetic для лечения рака, но она способна сокращать гель высокой плотности только примерно на 10%.

Степень выравнивания коллагена модулируется скоростью потока коллагена таким образом, что более высокая скорость потока коллагена приводит к лучшему выравниванию. Использование более узких каналов в сочетании с более высоким вакуумным давлением улучшает выравнивание коллагеновой сети, в то время как более широкий канал, используемый в сочетании с низким вакуумным давлением, генерирует случайные матрицы. После того, как вы освоитесь, заливка коллагеновых гелей или каналов может быть выполнена за два с половиной часа, если все выполнено правильно.

При выполнении этой процедуры важно не забыть настроить компоненты перед началом работы. Как только вы начнете работать с коллагеном, вам нужно работать быстро. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области 3D-клеточной биологии для изучения клеточной адгезии, миграции и инвазии клеток в трехмерную внеклеточную среду.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как заливать коллагеновые гели различной плотности и как генерировать, как случайные, так и выровненные коллагеновые матрицы.