Генерация маркированы и безмаркерных Мутанты в модельных видов цианобактерий

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать систему генерации немаркированных мутантов у видов цианобактерий Synechocystis PCC6803 и меченых мутантов у видов Synechococcus PCC7002. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генетики цианобактерий. Например, как ввести хромосомные изменения в штамм.

Путем вставки гена устойчивости к антибиотикам с последующим удалением этой кассеты с использованием отрицательного селективного маркера. Главное преимущество этой методики заключается в том, что штаммы можно многократно генетически манипулировать. Позволяя вводить столько изменений в сорт, сколько нужно.

После приготовления сред, штаммов цианобактерий и плазмид, согласно текстовому протоколу. Создайте свежую культуру, инокулируя петлю, полную клеток цианобактерий, в 30-50 миллилитров среды BG11. Выращивайте культуру при свете при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух-трех дней, до OD7500, равного 0,2 – 0,6.

После инкубации центрифугируйте один-два миллилитра культуры в дозе 2300 г в течение пяти минут. Затем, выбросив надосадочную жидкость, используйте среду BG11 для промывки гранул один раз, аккуратно пипетируя, чтобы повторно суспендировать клетки. Так как вортексинг может привести к потере пили, которые необходимы для усвоения ДНК.

После повторного гранулирования клеток и удаления надосадочной жидкости добавьте среду BG11 до конечного объема 100 микролитров и переложите клетки в пробирку с круглым дном объемом 14 миллилитров. Далее добавьте в клетки 1 микрограмм ранее приготовленной плазмиды А. И аккуратно постукивайте, чтобы перемешать.

Затем положите трубки горизонтально вниз в инкубатор при температуре 30 градусов Цельсия, и инкубируйте в течение четырех-шести часов. После инкубации распределить аликвоты смеси плазмидной ДНК клеточной культуры на агаровые планшеты BG11 без антибиотиков. И инкубируют при 30 градусах Цельсия.

Примерно через 24 часа приготовьте 0,6%-ный раствор агара в воде, содержащей канамицин. И даем ему остыть до 42 градусов по Цельсию. Затем добавьте от 2,5 до трех миллилитров к краям пластин для культуры и наклоните пластину, так раствор образует ровный верхний слой агара на поверхности.

Инкубируйте планшеты примерно семь дней, чтобы были видны колонии. Затем разделите свежую пластину BG11 агар плюс канамицин на шесть секторов. И используйте зубочистку с тупым концом, чтобы вырезать отдельные колонии.

Чтобы провести ПЦР, чтобы подтвердить выраженный нокаут, перенесите небольшое количество клеток в пробирку, содержащую 50 микролитров воды и примерно 20 стеклянных шариков от 425 до 600 микрометров. Встряхивайте ячейки и бусины со скоростью примерно 2 000 об/мин в течение пяти минут, а затем вращайте при 15 700 г в течение пяти минут. Затем с помощью пяти микролитров надосадочной жидкости готовят 50 микролитров ПЦР-реакций с предварительными ДНК.

Для валидации мутантов, после разработки праймеров по текстовому протоколу, амплифицируется продукт с помощью следующей программы, а также включается управление дикого типа. С помощью гелелектрофорезов верифицировать генотип нокаут-трансформантов. Показывает полосу примерно из четырех пар килооснований и не имеет полосы дикого типа.

Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительной информации. Если полоса дикого типа все еще присутствует, повторно нанесите штамм на свежую пластину и повторите ПЦР. Повторяйте процесс валидации до тех пор, пока мутант не будет отделен и в реакции ПЦР не будет обнаружено полосы дикого типа.

Для штамма с выраженным мутантным профилем повторите полосу на свежей пластине для использования в генерации немаркированного нокаута. Чтобы получить немаркированные мутанты Synechocystis, создайте свежую культуру отмеченного нокаута, инокулируя петлю, полную клеток, в 30-50 миллилитров среды BG11. Выращивают культуру в течение двух-трех дней до и OD750, равного 0,2 на 0,6.

Центрифугируйте 10 миллилитров культуры при 2300 г в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Затем с помощью среды BG11 аккуратно промыть ячейки. После добавления BG11 до конечного объема 200 микролитров и переноса клеток в пробирку с круглым дном объемом 14 миллилитров, добавьте к клеткам 1 микрограмм плазмиды B ДНК и аккуратно постукивающими движениями перемешайте.

Затем положите трубки горизонтально вниз в инкубатор, и инкубируйте в течение четырех-шести часов. После инкубации добавьте 1,8 миллилитра среды BG11 и инкубируйте образцы в общей сложности четыре дня при встряхивании. Это достаточное время для того, чтобы в нескольких хромосомных копиях произошла рекомбинация.

Положите 50, 10 и 1 микролитр аликвот преобразованной культуры на BG11 плюс 5% сахарозный агар и инкубируйте в течение примерно семи дней для получения одиночных колоний. Затем, используя зубочистку с тупым концом, вылупите от 30 до 50 отдельных колоний на пластинах BG11 плюс канамицин. Затем нанесите пластырь BG11 плюс 5% сахарозы.

Колонии, которые растут на BG11 плюс сахарозе, но не на пластинах с канамицином, являются потенциальными немаркированными нокаутами. Колонии, которые растут на обеих пластинах, вероятно, будут устойчивы к сахарозе из-за мутации в гене sacB. Следуя методу ПЦР, продемонстрированному ранее в этом видео, проверьте немаркированные нокауты, в результате чего образуется гелевая полоса, соответствующая размеру дикого типа за вычетом удаленной области.

Если штамм показывает немаркированный мутантный профиль, то повторно насадите его на свежий агар BG11 без антибиотиков. Чтобы хранить штаммы в течение длительного времени, создайте свежую культуру штамма, инокулировав петлю, полную клеток, в 30-50 миллилитров среды BG11. Выращивают культуру в течение трех-четырех дней, чтобы и OD750 равнялся 0,4 на 0,7.

После однократного использования BG11 для промывки клеток повторно суспендируйте гранулу примерно в двух миллилитрах BG11. Добавьте 0,8 миллилитра концентрированных клеток в одну пробирку. Затем добавьте 0,2 миллилитра 80%-ного фильтрованного стерилизованного глицерина.

В другую пробирку добавьте 0,93 миллилитра концентрированных клеток и 0,07 миллилитров ДМСО. Храните обе пробирки при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы оживить штаммы, удалите трубку и с помощью зубочистки с тупым концом соскребите некоторые клетки на агаровую пластину без антибиотиков.

Затем используйте стерильную петлю, чтобы сделать полосу как обычно. На этом рисунке показаны примеры плазмид A и B, используемых для генерации делеционных мутантов. В каждом случае пять простых и три простых площадных области составляют приблизительно от 900 до 1000 пар оснований.

Плазмида B также может содержать генную кассету между пятью простыми и тремя простыми областями примерно на одну килопару оснований. Или модифицированная версия нативной последовательности гена. После трансформации с помощью плазмиды А несколько сотен колоний появятся на пластине через 7-10 дней.

Если гены не являются существенными и мутанты демонстрируют рост, подобный штамму дикого типа, то все хромосомы должны содержать вставленную копию последовательности npt1/sacB, как это определено с помощью ПЦР. Если гены не являются существенными, а мутанты растут медленно, то для получения сегрегированного меченого мутанта необходимо несколько раундов повторного снаряжения с увеличением концентрации канамицина. Если при повторном тестировании меткий мутант не получается, ген, вероятно, необходим для выживания.

Большинство отдельных колоний, полученных в результате трансформации с помощью плазмиды В, будут чувствительны к канамицину и устойчивы к сахарозе. Как показано здесь, ПЦР-амплификация целевого участка в этих колониях показывает, что почти 100% немаркированного мутантного профиля. После освоения этой техники ее можно выполнять за несколько часов в течение шести недель, если она выполняется правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об использовании стерильной техники. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как измерение производства кислорода или газовая хроматографическая масс-спектрометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как измерение скорости фотосинтеза или производства метаболитов. После своего развития эта методика открыла путь для исследователей в области генетики цианобактерий.

Изучить ключевые биохимические и физиологические процессы в этом типе, а также разработать штаммы в промышленных целях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как генерировать немаркированные нокауты у видов Synechococcus PCC6803.