Получение и анализ In Vitro Трехмерное карциному груди Суррогаты

Общая цель этого набора процедур состоит в том, чтобы создать трехмерные клеточные культуры, которые будут функционировать в качестве суррогатов рака молочной железы in vitro, а также представить метод измерения роста клеток в гистологических срезах суррогатов. Трехмерная клеточная культура является более физиологически значимым методом моделирования поведения клеток in vitro, чем двумерная клеточная культура. Изменяя клеточный состав в экспериментальных условиях, этот набор процедур может быть адаптирован для решения различных биологических вопросов и для оценки эффективности потенциальных методов лечения.

Чтобы включить элементы в ЭВМ, на льду добавьте элементы и первые четыре связанных компонента, перечисленные в таблице 1 в прилагаемой рукописи, в двухмиллиметровую микроцентрифужную пробирку. Затем аккуратно перемешайте их с помощью пипетки, не допуская образования пузырьков. Контролируйте уровень pH с помощью фенолового красного цвета в 10XD MEM, чтобы убедиться, что смесь имеет оранжево-розовый цвет, указывающий на pH семь градусов.

Если смесь выглядит желтой, а pH слишком низкий, медленно добавляйте 7,5-процентный бикарбонат натрия по одной капле за раз, пока не будет достигнут соответствующий цвет. Не забывайте держать смесь на льду и работать быстро, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию ECM. Для твердых 3D-культур держите предметное стекло камеры на льду, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию ECM.

Медленно нанесите пипетку по 100 микролитров смеси ЭХМ ячейки в каждую лунку предметного стекла с восемью лунками и нанесите смесь ЭХМ ячейки по краям лунки, чтобы помочь лучше распределить смесь. Затем инкубируйте суррогаты при температуре 37 градусов Цельсия (пять процентов CO2) в течение 45 минут, чтобы обеспечить полимеризацию ECM. Через сорок пять минут добавьте по 100 микролитров питательной среды в каждую лунку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах CO2 в течение всего эксперимента.

Меняйте питательную среду каждые два дня. Ограничением 3D-культуры является то, что диффузия кислорода и питательных веществ в объеме может быть недостаточной для поддержания жизнеспособности клеток. Добавление биореакторной системы может помочь преодолеть это ограничение и усилить рост.

Чтобы размножить 3D-культуры в биореакторной системе, стерильно подготавливают и собирают ту часть биореакторной системы, в которой размещаются суррогаты. В капюшоне для клеточных культур с помощью шприца с иглой 26 калибра введите клеточную смесь ЭХМ в область перфузионного биореактора, предназначенного для содержания клеток, и быстро перейдите к следующему этапу. Чтобы обеспечить более равномерное распределение клеток внутри суррогатов, поместите компонент биореактора, в котором находятся суррогаты, в коническую трубку объемом 50 миллилитров.

Непрерывно вращайте суррогаты со скоростью 18 об/мин во время инкубации при 37 градусах Цельсия в печи для гибридизации in situ или инкубаторе в течение 45 минут, чтобы обеспечить полимеризацию ECM. После полимеризации и добавления среды соедините узел биореактора с насосом. Запустите среднюю перфузию в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, пять процентов CO2.

Продолжайте перфузию среды в течение всего эксперимента и меняйте питательную среду в соответствии с требованиями конкретного плана эксперимента. В конце эксперимента заключите суррогаты в гель для обработки образцов, чтобы сохранить суррогаты нетронутыми во время обработки и облегчить гистологическое срезирование. Для этого растопите гель для обработки образца на водяной бане при температуре 60 градусов Цельсия до готовности к использованию.

Затем нанесите пипеткой около 300 микролитров геля для обработки образцов на дно меченой криоформы. С помощью лезвия скальпеля и щипцов осторожно извлеките суррогат из биореактора или из лунки предметного стекла с восемью лунками и поместите его в криоформы, содержащие гель для обработки образцов. Пипеткой нанесите примерно 300 микролитров геля для обработки образца, чтобы покрыть суррогат в криоформе.

Затем инкубируйте его при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут. После того как гель для обработки образцов застынет, удалите гель для обработки образцов, содержащий суррогат, из криомолда и поместите его в тканевую кассету. Если в одну и ту же тканевую кассету должно быть помещено более одного суррогата, для различения образцов после фиксации и обработки можно использовать тканевые маркирующие красители.

Затем поместите тканевую кассету, содержащую суррогат, в 10% нейтральную буферную формулу на 10-12 часов при комнатной температуре, чтобы обеспечить полную фиксацию. После фиксации переведите тканевую кассету, содержащую суррогат, на 70 процентов этанол. Теперь фиксированный суррогат готов к обработке в парафин и последующему гистологическому срезу.

Чтобы измерить плотность клеток и получить фотомикроскопические изображения окрашенных H и E срезов, откройте файл изображения суррогата. Используя инструмент «Многоугольник» в ImageJ и края ECM в качестве ориентира, очертите область суррогата, перетаскивая мышь и щелкая мышью, чтобы создать опорные точки. После создания контура выберите «Измерить» на вкладке «Анализ».

Затем загрузите файлы изображений, используемые для измерения суррогатной области, в Cell Profiler, перетащив файлы изображений в список файлов. Затем назначьте имя каждому изображению, импортированному в модуль импорта имен и типов, и выберите тип изображения. После создания конвейера анализа запустите тестовый режим и нажмите кнопку «Запустить в профилировщике ячеек».

И оцените отфильтрованные объекты, чтобы убедиться, что большинство ядер на тестовом изображении правильно идентифицированы, а оптимальные параметры выбраны для идентификации клеток. Включенные в него ядра будут обведены зеленым цветом. Затем сохраните проект, выйдите из тестового режима и нажмите «Анализировать изображения».

Здесь показано репрезентативное изображение окрашенного H и E среза перфузированного суррогата, выращенного в течение семи дней. А это репрезентативное изображение окрашенного H и E участка от твердого суррогата, выращенного в течение семи дней со сменой среды каждые два дня. У солидных суррогатов клеточность значительно ниже.

На этом графике показано сравнение среднего количества ядросодержащих клеток на одну область после семи дней роста. Перфузированный и добротный суррогат. Эти численные данные подтверждают клеточность на микрофотографиях окрашенных H и E срезов.

На этом графике показано сравнение индекса мечения Ki-67, который является показателем пролиферации клеток после семидневного роста перфузированных и твердых суррогатов. Эти данные снова подтверждают больший рост числа перфузированных суррогатных матерей. После этой процедуры другие методы, такие как гибридизация in situ и аминогистохимия, могут быть выполнены на гистологических срезах суррогатных матерей, чтобы ответить на такие вопросы, как экспрессия РНК и белка.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как готовить и обрабатывать трехмерные суррогаты тканей in vitro, а также выполнять суррогатный анализ на гистологических срезах, окрашенных H и E.