Сканирующая электронная микроскопия из размоченной ткани для визуализации внеклеточный матрикс

Общая цель этого метода заключается в визуализации структуры сердечного матрикса в отсутствие клеток или других нематричных материалов. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области фиброза, особенно на то, как различия в содержании матрицы могут повлиять на организацию матрицы, и как эти изменения могут повлиять на различные кардиомиопатии или другие фиброзные заболевания. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает качественное представление матрицы, которое может быть использовано для дополнения количественных показателей.

Д-ру Галиндо и д-ру Сойеру впервые пришла в голову идея использовать эту технику после того, как они обнаружили, что регулярное лечение свиней после инфаркта сопровождалось изменениями в экспрессии генов, которые были аналогичны изменениям в содержимом матрицы после лечения. Люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, если у них нет предыдущего опыта подготовки образцов СЭМ, из-за необходимых навыков мелкой моторики. Образец ткани должен быть достаточно большим, чтобы его можно было легко увидеть, и храниться в четырехпроцентном растворе глутаральдегида при температуре четыре градуса Цельсия.

Достаньте салфетку из холодильника и промойте ее в дистиллированной воде. Затем погрузите ткань в раствор 10-процентного гидроксида натрия, приготовленный из свежих гранул в воде. Обязательно принимайте надлежащие меры предосторожности.

Держите ткань в растворе гидроксида натрия от шести до 10 дней при комнатной температуре. Приступайте к работе, когда цвет ткани станет грязно-белым или белым. Затем промойте ткань дистиллированной водой, пока она не станет прозрачной.

Далее наденьте перчатки и погрузите ткань в однопроцентную дубильную кислоту на четыре часа при комнатной температуре. После ванны с дубильной кислотой промойте ткань в дистиллированной воде на ночь. При приготовлении, в вытяжном шкафу в перчатках, внесите 0,2 молярного стокового раствора буфера какодилата натрия и двухпроцентный водный исходный раствор тетраоксида осмия.

Используйте защиту от брызг, так как тетраоксид осмия представляет серьезную опасность при вдыхании. Теперь сделайте 0,1 молярное разведение буфера какодилата натрия и инкубируйте ткань в нем в течение пяти минут с легким перемешиванием. Дважды меняйте буфер, чтобы промыть ткань в общей сложности три раза с какодилатом натрия.

Далее приготовьте смесь один к одному из стокового какодилата натрия и стокового тетраоксида осмия. Инкубируйте ткани в новой смеси на ротаторе в течение часа. Позже верните ткань к 0,1 молярного какодилата натрия и инкубируйте ее с легким перемешиванием в течение пяти минут.

Меняйте этот раствор для ванны дважды в течение 15 минут. Затем обезвожьте ткань с помощью серии ванн с этанолом с возрастающей концентрацией. Дайте ткани впитаться в течение 15 минут в каждой ванне с легким помешиванием.

Далее перенесите ткань и раствор в неглубокую чашку Петри, наполненную 100-процентным этанолом. Затем осторожно держите два очень острых бритвенных лезвия так, чтобы плоскости сторон соприкасались друг с другом, а режущие края пересекались, образуя две стороны равностороннего треугольника над образцом. Теперь используйте доминирующую руку, чтобы поместить второе лезвие в крайнюю левую часть образца, и разрежьте вправо.

Таким образом, сдвиньте лезвия друг против друга с противоположных направлений, чтобы сделать один гладкий разрез с минимальным искажением или рвущей силой. Цель состоит в том, чтобы обнажить как можно большую площадь поверхности, не повреждая образец. Повторяйте процесс до тех пор, пока не будет подготовлено достаточное количество удовлетворительных сечений для исследования с помощью SEM.

С помощью шпателя или пинцета перенесите ткань в держатель образца CPD, сохраняя при этом ткань погруженной в 100-процентный этанол. Ткань не может подвергаться воздействию воздуха более нескольких секунд. Используйте CPD для замены этанола жидким углекислым газом и выполните цикл сушки в соответствии с указаниями производителя.

Затем подготовьте корешок образца SEM для каждого образца. Приклейте угольный клей к верхней поверхности алюминиевого заглушки. Под стереоскопом тщательно приклейте образец к клеевому язычку так, чтобы интересующая поверхность поперечного сечения была обращена вверх, в сторону от выступа, и максимально плоско с поверхностью заглушки.

Не прощупывайте и не прикасайтесь к интересующей поверхности. Для самых маленьких и сложных экземпляров сломайте деревянную палочку-аппликатор, чтобы использовать ее в качестве шпателя. Кроме того, работайте над большим листом фильтровальной бумаги, чтобы не потерять упавший образец.

Для улучшения адгезии используйте сломанную палочку-аппликатор, чтобы сделать коническую кисть, и нанесите серебряную или углеродную краску на основание и бока образца. Протяните очень тонкую линию краски до края интересующей поверхности. Это позволит проложить путь заряда от интересующей поверхности к земле.

Затем нанесите два или три небольших мазка краской по периметру угольного язычка, чтобы обеспечить проводящий путь от поверхности язычка к металлическому стержню. Он функционирует как заземление. Отложите образец в сторону и дайте проводящей краске высохнуть в течение двух часов.

После высыхания с помощью распылительной установки для нанесения покрытия на образец нанесите относительно толстый слой золота, палладиевого сплава или золота. Желательно покрытие толщиной от 30 до 40 нанометров. Выполните сканирующую электронную микроскопию при относительно низком ускоряющем напряжении, чтобы свести к минимуму проблемы, связанные с плохим рассеиванием заряда в образце.

Используйте режим переменного давления, если он доступен. Во-первых, увеличьте рабочее расстояние, чтобы обеспечить достаточную глубину резкости для фокусировки на волокнах в Z-измерении. Для этого откройте вкладку «Навигация» в правом верхнем углу.

Затем перейдите на вкладку «Координаты» в меню этапа. В нем введите большее значение координаты Z, например 20 миллиметров. Наконец, нажмите вкладку «Перейти к», чтобы выполнить изменение.

Затем расположите интересующую поверхность ортогонально электронному пучку. Нажмите и удерживайте правую кнопку мыши, затем сдвиньте ее влево или вправо, чтобы сфокусировать образец вблизи периферии подготовленной интересующей плоскости поверхности. Обратите внимание на сфокусированное рабочее расстояние.

Затем с помощью ручного джойстика пользовательского интерфейса переместите вид на противоположный край и повторите метод фокусировки. Если рабочее расстояние изменилось, наклоните образец так, чтобы достичь приблизительного совпадения в обоих местах. Используйте вкладку «Координаты» в меню «Сцена» и введите значение наклона в координату T.

Теперь поверните образец на 90 градусов, введя это значение в поле координат R. Затем повторяйте процесс наклона до тех пор, пока все положения не будут сфокусированы примерно на одном и том же рабочем расстоянии. Описанная методика была применена к тканям сердца от неиспользованного донора трансплантата человеческого сердца.

Сердечный матрикс человека представляет собой сложное переплетение сшитых белков, которое имеет сотовый узор в поперечном сечении. Каждая сотовая структура имеет ширину около 40 микрон, обычно обходя один миоцит. При соединении интеркалированными дисками несколько кардиомиоцитов можно представить в виде стержня, проходящего вдоль через туннельную форму.

В дополнение к предоставлению структурной информации, SEM децеллюляризованных тканей может позволить провести значимую качественную оценку в ответ на травму или нетравматичные формы кардиомиопатии, такие как инфаркт сердечных тканей от свиньи. В отдельном исследовании было показано, что изоформа GGF2 NRG-1 бета является потенциальным терапевтическим средством для лечения сердечной недостаточности. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как обрабатывать ткани, ткани сердца, для сканирующего электронного микроскопа, включая технику экспонирования интересующей вас поверхности и монтажа образца.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как масс-спектрометрия, секвенирование РНК и различные другие анализы для измерения белков внеклеточного матрикса и других белков, ответственных за передачу сигналов и другие явления организационного наблюдения. Кроме того, не стоит забывать, что тетраоксид осмия является опасным химическим веществом из-за возможности парофиксации слизистых оболочек. Всегда помните о работе в вытяжном шкафу в нитриловых перчатках, используя защиту от брызг или створку колпака.