In Vitro Колонии Assays Характеризуя Tri-сильнодействующие прогениторных клеток , выделенных из мышиной поджелудочной железы для взрослых

Общая цель этих протоколов состоит в том, чтобы охарактеризовать клеточные колонии, выращенные из клеток-предшественников поджелудочной железы, выделенных от взрослых мышей, с использованием анализов культур, в которых используется полутвердая среда, содержащая метилцеллюлозу. Наши методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии клеток-предшественников поджелудочной железы, такие как: каковы способности к самообновлению и дифференцировке клеток-предшественников взрослой поджелудочной железы? Основное преимущество этих методов заключается в том, что они позволяют изучать отдельные клетки-предшественники, что важно для определения их истинного биологического потенциала.

Впервые идея этих методов пришла нам в голову, когда мы поняли, что анализы колоний, изучающие гемопоэтические стволовые клетки, также могут быть применены к популяциям клеток поджелудочной железы. Демонстрировать процедуры будут Джейкоб Тремблей, аспирант, доктор Джанин Кихано, постдок, и мисс Анджела Луо, техник, все из моей лаборатории. Как можно скорее после жертвоприношения с помощью ножниц сделайте вертикальный разрез по средней линии брюшной стенки, и вскройте брюшную полость.

С помощью щипцов аккуратно приподнять селезенку, разрезая ножницами соединительную ткань между селезенкой и селезеночной долей поджелудочной железы. Таким же образом разрежьте соединительные ткани для долей двенадцатиперстной кишки и желудка и поместите ткани поджелудочной железы в чашку Петри, содержащую DPBS с добавлением 0,1% BSA и антибиотики на льду. Затем под препарирующим микроскопом с помощью щипцов с тонким кончиком удалите жировую ткань.

Теперь перенесите поджелудочную железу в капюшон для культуры тканей и промойте ткань в трех последовательных 100-миллиметровых чашках Петри, содержащих 10 миллилитров холодной PBS плюс BSA каждая. После окончательного промывания поместите панкреату в стерильную сухую чашку Петри, чтобы удалить как можно больше PBS плюс BSA, и переложите салфетки в другую сухую чашку Петри на льду. Затем с помощью пружинных ножниц измельчите панкреату в течение двух-трех минут, пока не образуются мелкие кусочки ткани, и суспензируйте фрагменты ткани в двух-трех миллилитрах свежеприготовленного холодного раствора PBS BSA DNase I.

С помощью пипетки объемом 10 миллилитров переложите кусочки в коническую трубку объемом 50 миллилитров и добавьте достаточное количество PBS BSA DNase I, чтобы довести общий объем до 10 миллилитров. Затем добавьте в ткани от 350 до 450 микролитров коллагеназы В. Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на восемь минут, поворачивая каждые три-четыре минуты.

В конце инкубации с помощью 10-миллилитрового шприца с иглой 16 с половиной калибра наберите и затем распылите тканевый раствор вниз по стенке 50-миллилитровой трубки при комнатной температуре семь раз. Затем верните салфетки на водяную баню еще на восемь минут, время от времени поворачивая, после чего последовали семь проходов через шприц, как показано выше. После последнего механического нарушения перенесите аликвоту клеточной суспензии объемом 10 микролитров на сухую чашку Петри и подтвердите наличие одиночных клеток и небольших клеточных кластеров под микроскопом с инвертированным фазово-контрастным светом с объективом 10x.

Затем поместите пробирку на лед и доведите общий объем до 50 миллилитров с помощью PBS BSA DNase I. Центрифугируйте клетки и с помощью пипетки P1000 повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах холодной PBS BSA DNase I. Затем отфильтруйте клетки через нейлоновый сетчатый фильтр 70 микрон, а затем нейлоновый сетчатый фильтр 40 микрон в новую полипропиленовую коническую трубку объемом 50 миллилитров. Отрегулируйте объем до 5 миллилитров PBS BSA DNase I, и подсчитайте клетки. Затем разведите одноклеточную суспензию до конечной концентрации в два раза по 10 до 7 клеток на миллилитр в холодном PBS BSA DNase I на льду.

Для полного окрашивания колонии поджелудочной железы, выращенных в метилцеллюлозесодержащей полутвердой среде, сначала готовят стеклянную пипетку Пастера с тонким отверстием с помощью горелки Бунзена. Затем прикрепите маленький конец наконечника для пипетки объемом в один миллилитр к одному концу тонкостенной резиновой трубки, а мундштук — к другому концу. Прикрепите стеклянную пипетку Пастера к большому концу наконечника пипетки.

Затем наберите от 10 до 50 микролитров среды DMEM/F12 с одним процентом метилцеллюлозы в ротовую пипетку. Теперь поместите чашку с колониями на предметный столик с инвертированным фазово-контрастным микроскопом и используйте объектив 10x, чтобы найти подходящие колонии для сбора. Затем поместите отверстие пипетки рядом с интересующей колонией и медленно приложите всасывание ко рту, чтобы выбрать одну колонию.

Для эффективного сбора важно убедиться, что интересующая колония находится в фокусе, прежде чем размещать отверстие стеклянной пипетки рядом с кластером клеток. После того, как колония будет собрана, поместите наконечник пипетки в одну лунку 96-луночного планшета, содержащую 4% параформальдегида, и поместите колонию в лунку. После того, как все колонии будут собраны, зафиксируйте колонии на ночь при температуре в четыре градуса Цельсия с помощью осторожного встряхивания.

На следующее утро промойте колонии два раза в PBS в течение 10-30 минут при комнатной температуре. С этого момента отбирайте колонии с помощью пластиковой пипетки P10 с загнутым кончиком. После второй промывки храните зафиксированные колонии на ночь в 1,5-миллилитровых пробирках, наполненных парафином при температуре четыре градуса Цельсия.

Затем переложите колонии в отдельные лунки 96-луночной черной пластины с прозрачным дном, содержащей 200 микролитров блокирующего буфера на лунку. Выдержите тарелку в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, слегка встряхивая. На следующее утро перенесите колонии в новые лунки, содержащие 200 микролитров первичного антитела, представляющего интерес для другой ночной культуры при четырех градусах Цельсия, с легким встряхиванием.

На следующее утро переложите колонии в три последовательные лунки, содержащие 200 микролитров PBS плюс 0,1% Tween 20 на 10 минут промывки при комнатной температуре. После третьей промывки переложите колонии в чистые лунки, содержащие 200 микролитров соответствующего вторичного антитела, и выдержите пластину при комнатной температуре в течение двух часов в темноте. По окончании инкубации промойте колонии три раза в PBS Tween, как только что продемонстрировано, и пересадите колонии в новые лунки DAPI на пять минут при комнатной температуре.

Затем сгруппируйте иммуноокрашенные колонии в чашку Петри со стеклянным дном диаметром 35 миллиметров и накройте их крышкой. Наконец, изобразите колонии на конфокальном микроскопе. Взрослые клетки-предшественники поджелудочной железы могут быть обогащены путем сортировки активированных флуоресцентных клеток с использованием соответствующих параметров гейтирования, поскольку способность к образованию колоний обнаруживается только в CD133 Sox9/EGFP-положительных протоковых клетках.

Затем колонии поджелудочной железы могут быть классифицированы в соответствии с их морфологией с помощью микроскопии инвертированной фазово-контрастной световой микроскопии. После ручного сбора колонии также могут быть проанализированы с помощью микрофлюидного анализа qRT-PCR на экспрессию генов или с помощью иммуноокрашивания на экспрессию белка. Действительно, многие отдельные колонии экспрессируют линейные маркеры для протоковых, эндокринных и ацинарных клеток, например, указывая на то, что большинство инициирующих предшественников колоний поджелудочной железы для этих колоний являются трипотентами.

После освоения процедуры диссекции, распыления, окрашивания и сортировки клеток, а также нанесения покрытия на полутвердую среду, содержащую метилцеллюлозу, могут быть завершены за шесть-семь часов, если они выполнены правильно. После формирования колонии могут быть выполнены другие методы, такие как количественная ОТ-ПЦР, вестерн-блот или анализ секреции инсулина, чтобы ответить на дополнительные вопросы об экспрессии генов или функциональных способностях колоний. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как диссоциировать поджелудочную железу взрослой мыши и как охарактеризовать колонии, генерируемые клетками-предшественниками поджелудочной железы в полутвердых культурах, содержащих метилцеллюлозу.