Генерация ESC происхождения мыши эпителиальных клеток дыхательных путей с использованием легких Decellularized Строительные леса

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы направить дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши в зрелые эпителиальные клетки дыхательных путей с использованием 3D-культуры, созданной с использованием децеллюляризованных скаффолдов легких. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития легких, такие как роль сокращений клеточного матрикса и передачи сигналов фактора роста во время дифференцировки линии легких. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует 3D-систему культивирования в определенных условиях, свободных от сыворотки, и обеспечивает надежную дифференцировку эпителия дыхательных путей с ограниченной контаминацией от других линий энтодермы. После усыпления взрослой крысы Вистар, согласно текстовому протоколу, закрепите животное на препарирующей поверхности, зафиксировав передние и задние лапы, и используйте 70% этанол для распыления вниз по груди и животу. Сделайте разрез чуть ниже грудной клетки. Разрежьте кожу и обнажите диафрагму. Затем сделайте небольшие разрезы через диафрагму, чтобы заставить легкие втянуться, снижая вероятность прокола легких. Затем сделайте вертикальный разрез вдоль грудины и откройте грудную полость, чтобы получить доступ к сердцу и легким. Затем с помощью шва перевязать нижнюю полую вену и с помощью небольших ножниц для рассечения сделать небольшой разрез в левом предсердии. С помощью подготовленного шприца объемом 10 мл с иглой 25 калибра, заполненной гепаринизированным раствором соли Hank's Balance, начните перфузию легких, вставив иглу в правый желудочек, и протолкните буфер через легочный круг кровообращения. Продолжайте перфузию до тех пор, пока легкие не станут белыми, а жидкость, вытекающая из левого предсердия, не станет прозрачной. После перфузии обнажите трахею, и сделайте небольшой разрез возле щитовидного хряща для канюляции. Затем с помощью пластикового катетера канюлируйте трахею и с помощью шва закрепите ее на месте. Теперь настройте гравитационную систему перфузии, закрепив шприц объемом 10 мл на ретортной стойке и зажиме. Затем извлеките и выбросьте поршень шприца. Закрепите максимальную точку наполнения на цилиндре шприца на высоте 20 см над легкими, затем прикрепите двусторонний запорный кран к концу шприца, а длинную пластиковую трубку — к другому концу запорного крана. Аккуратно вытащите катетер из трахеи и прикрепите его к концу пластиковой трубки. Затем налейте раствор децеллюляризации в шприц и дайте раствору полностью заполнить прикрепленную пластиковую трубку и катетер. Поместите заполненный раствором катетер обратно в трахею и промывайте легкие, наполняя их до полной емкости легких в течение одной минуты. Затем извлеките катетер из трахеи, чтобы жидкость могла вытекать из легких. Повторите промывание легких восемь раз раствором для децеллюляризации, а затем десять полосканий PBS. Легкие будут казаться белыми после завершения этапов промывания зубов. Затем рассекают трахею и легкие от шеи и грудной полости. Удалите лишнюю ткань из рассеченных легких, включая пищевод и сердце, затем переведите легкие в холодный PBS до подготовки к рассечению вибратома. Чтобы приготовить толстые срезы, сделайте примерно 15мл агарозы с низкой температурой плавления 2% и 4% в PBS, и достаточно 6% агарозы для встраивания всех лепестков в небольшие прямоугольные блоки. После переноса агарозы в пробирки объемом 15 мл поместите пробирки на нагревательный блок и поддерживайте температуру выше 40 градусов по Цельсию, чтобы избежать гелеобразования. С помощью маленьких ножниц рассеките децеллюляризованное легкое на конце каждого долевого бронха и отделите каждую долю. Затем используйте абсорбирующие листы, чтобы удалить излишки PBS, и перенесите доли до 2% агарозы на нагревательный блок на пять минут, чтобы покрыть ткань. После переноса каждой доли в чашку Петри поместите чашку на холодную тарелку и дайте поверхности загустеть в течение одной минуты. Аккуратно поместите доли в 4%-ную агарозу, а после инкубации в течение пяти минут и остывания повторите покрытие 6%-ной агарозой. После нанесения покрытия используйте формы на металлической основе, чтобы встроить каждую долю отдельно в 6%-ную агарозу, при этом не менее 3 мл агарозы окружают ткань с краев. Затем с помощью щипцов сориентируйте каждую долю, расположив самый большой плоский край ткани на поверхности металлической формы, обращенной к экспериментатору, и завершите встраивание с помощью пластиковых кассет. Дайте блокам загустеть на холодной пластине не менее 30 минут перед вибратомным сечением. В качестве альтернативы храните блоки во влажной камере до 12 часов при температуре четыре градуса Цельсия перед вибратомным сечением. Для подготовки секций настройте вибратом, заполнив секционную камеру холодным PBS. Установите окружающую ледяную ванну, чтобы поддерживать холодную температуру на протяжении всей секции. Теперь извлеките блоки из металлических форм и с помощью бритвенного лезвия обрежьте излишки агарозы вокруг лопастей, сохраняя при этом примерно три миллиметра от края ткани. С помощью клея закрепите ткань в центре пластины для образца и погрузите пластину в камеру секционирования, заполненную PBS. Нагрузите режущее лезвие на вибратом. Задайте границы сечения на вибратоме, выбрав следующие значения скорости, амплитуды и толщины соответственно. Разрежьте каждую долю полностью, и если секции не полностью отделяются друг от друга, используйте маленькие ножницы, чтобы вручную вырезать секции. Затем аккуратно соберите секции лесов и переложите в холодные ПБС. С помощью щипцов аккуратно освободите каждый участок от окружающей агарозы. Для обеззараживания секций каркаса, после переноса их из PBS в микроцентрифужные пробирки, добавьте 90 единиц на миллилитр нуклеазы в PBS и инкубируйте на ротаторе при комнатной температуре от 12 до 24 часов. После переноса секций в новые микроцентрифужные пробирки, согласно текстовому протоколу, в стерильных условиях добавляют антимикробный раствор, и инкубируют на ротаторе при комнатной температуре в течение шести часов. Затем в стерильных условиях используйте PBS для двукратной промывки каркасов и переносите их в среду, свободную от сыворотки, или SFDM, перед посевом с клетками. Чтобы создать культуру на границе раздела воздушной жидкости, используйте стерильные щипцы для размещения гидрофобных мембран на чашке Петри. Затем перенесите каждую секцию децеллюляризованного каркаса из SFDM на мембрану, обеспечив равномерное распределение секций по мембране. Приготовьте шесть или двенадцать луночных тарелок, заполнив лунки 1 мл или 0,5 мл SFDM соответственно. Затем аккуратно поместите мембраны в лунки, позволяя мембране плавать поверх среды, создавая воздушную жидкую культуру. Для посева 3D-скаффолдов, после подготовки эндодермальных клеток и сортировки флуоресцентно активированных клеток, для обогащения для окончательной энтодермы, используйте гемоцитометр для подсчета отсортированных клеток. Затем вращайте ячейки при давлении 400 G в течение пяти минут. Используя SFDM, повторно суспендируйте гранулированные ячейки примерно до 100 000 ячеек из 10