Цельноклеточной патч-зажим Записи в головном мозге Ломтики

Общая цель этой процедуры — описать, как выполнять запись целых клеток в только что препарированных срезах мозга. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, о том, как экспериментальные манипуляции с контролем изменяют активность конкретных нейронов в определенных областях мозга. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает среду для идентификации препарата X vivo долгосрочных изменений в функциях нейронов, которые развились у неповрежденных бодрствующих животных.

Хотя этот метод может дать представление о функциях нейронов в срезах мозга, он также может быть применен к другим системам, таким как клетки в культуре и нейроны in vivo. Демонстрировать процедуру будет Франсиско Гарсия-Оскос, студент из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, с помощью пластиковой переводной пипетки с обрезным наконечником аккуратно вытащите один срез мозга из камеры восстановления.

Поместите переводную пипетку в камеру записи и осторожно выдавите срез из пипетки на скользящую подкладку крышки в нижней части камеры. Далее, используя объектив микроскопа 4x, расположите срез так, чтобы нужная область располагалась точно в центре записывающей камеры. После того, как желаемое положение будет достигнуто, закрепите положение среза мозга с удержанием среза, также известным как арфа.

После этого переключитесь на объектив 40x и осторожно опустите объектив до тех пор, пока он не соприкоснется с ACSF в камере. Затем используйте колесо точной регулировки, чтобы сфокусировать ткань. Когда очаг находится на уровне тканей, наблюдайте за клетками в целевой области.

Теперь ищем целевую клетку. Отметьте его на экране компьютера, чтобы помочь направлять записывающую микропипетку. Поднимите линзу объектива, чтобы оставить достаточно места для размещения записывающей микропипетки.

На этом этапе с помощью одномиллилитрового шприца, неметаллической иглы для микрошприца и специального фильтра заполните микропипетку заранее приготовленным внутренним раствором. Убедитесь, что в микропипетке нет пузырьков воздуха. Затем поместите микропипетку в держатель электрода, чтобы раствор соприкасался с проволочным электродом, покрытым хлоридом серебра.

Затяните колпачок пипетки так, чтобы шайба конуса образовала уплотнение вокруг микропипетки. Затем приложите положительное давление с помощью наполненного воздухом шприца, подключенного к держателю пипетки, прежде чем погрузить микропипетку в ACSF, чтобы предотвратить попадание в нее мусора. С помощью микроманипулятора направьте пипетку вниз к камере так, чтобы она находилась примерно под центром погруженного объектива.

Перемещая микропипетку с помощью микроманипулятора со средней и высокой скоростью, найдите микропипетку на экране компьютера и направьте микропипетку к расположению ячейки по оси XY. В то же время измерьте сопротивление микропипетки, применяя шаг напряжения. Приложите положительное давление, чтобы удалить пузырьки воздуха или другие посторонние предметы, блокирующие микропипетку.

После очистки микропипетки выполните коррекцию напряжения, чтобы снизить ток пипетки до нуля. С помощью колеса точной фокусировки микроскопа начните фокусироваться вниз, постепенно опуская микропипетку. Всегда сначала фокусируйтесь вниз, а затем опускайте микропипетку в плоскость фокусировки, чтобы наконечник микропипетки не проник резко в срез.

Когда микропипетка соприкоснется с поверхностью среза, снизьте скорость микроманипулятора до средне-низкого режима. Осторожно надавливайте легкими положительными нагрузками, чтобы убрать мусор на дорожке. Затем подойдите к ячейке, чередуя ручки управления XYZ, или приближаясь по диагонали, где обе оси XZ изменяются при вращении ручки оси Z.

Когда микропипетка находится достаточно близко к клетке, на поверхности клетки появляется ямочка. Теперь примените слабое и кратковременное всасывание через трубку, которая соединена с всасывающей трубкой держателя пипетки, чтобы создать уплотнение. Во время формирования гига-уплотнения используйте управляемый компьютером усилитель, чтобы довести клетки, удерживающие потенциал, до физиологического потенциала покоя, чтобы предотвратить резкие изменения после разрыва мембраны.

После того, как гига-печать сформируется, компенсируйте быстрые или медленные капазитоны. Здесь очень важно, чтобы применяемое отсасывание не было слишком сильным. В противном случае мембрана может разорваться до установления уплотнения.

Если уплотнение остается стабильным и превышает один гигаом, примените кратковременное и сильное отсасывание для разрыва плазматической мембраны. Всасывание должно быть коротким и более сильным, чем давление, оказываемое при установке уплотнения. Для того, чтобы правильно разорвать мембрану, и добиться стабильной цельноклеточной конфигурации.

Переключившись в режим ячейки в мембранном тесте, просмотрите различные параметры ячейки, такие как входное сопротивление, последовательное сопротивление и мембранные конденсатоны. После достижения конфигурации всей ячейки продолжайте отслеживать эти параметры во время записи. Здесь показан пример наклона вызванных EPSCs из оболочки MSN с одним ядром accumbens.

Повышение температуры с 24 до 28 и до 32 градусов по Цельсию, увеличивает наклон вызванных EPSC. При этом амплитуда вызванных EPSC оценивается в режиме зажима напряжения при напряжении минус 80 мВ. При увеличении последовательного сопротивления амплитуда вызываемого EPSCS уменьшается.

А вот пример следов от двух нейронов, показывающих влияние входного сопротивления на способность нейрона генерировать спайки. Нейроны зажимаются током и удерживаются при напряжении минус 80 милливольт. Когда входное сопротивление увеличивается, количество потенциалов действия также увеличивается.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что создание здоровых срезов мозга имеет решающее значение. Также важно контролировать параметры, которые могут влиять на форму волны электрического сигнала, такие как последовательное сопротивление, входное сопротивление и температура. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление об основных аспектах техники записи целых клеток в срезах мозга.