Ex Vivo Культура и Pattern Recognition Рецептор Стимуляция мыши Кишечные органоидами

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы измерить влияние патогенного воздействия на органоиды тонкой кишки с акцентом на методы нормализации по отношению к общему количеству клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области врожденной иммунологии и иммунологии слизистых оболочек, предоставляя средства для исследования взаимодействия патогенов хозяина бактерий с эпителиальными клетками кишечника in vitro. Важным для этой процедуры является метод нормализации по отношению к общему количеству клеток, что необходимо при измерении секретируемых органоидов белков с помощью таких методов, как сбор крипт тонкой кишки мыши для культивирования органоидов, ELISA.To использования стерильного предметного стекла для аккуратного соскабливания ворсинок с просветной поверхности тонкой кишки. Далее с помощью ножниц для препарирования разрежьте ткань на полоски длиной 1-2 сантиметра. И поместите полоски в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 10 миллилитров ледяного PBS. Перемешайте содержимое путем осторожной инверсии и дайте содержимому ткани осесть на дно пробирки. Затем отсадите PBS и промойте полоски еще три раза в 10 миллилитрах свежего PBS, каждый раз таким же образом. По окончании окончательной промывки поместите трубку на лед на десять минут. Затем замените PBS на 25 миллилитров PBS с добавлением 2 миллимоляров ЭДТА в ведре со льдом на качающейся платформе в течение 45 минут. В конце инкубации дайте тканевым полоскам осесть на дно трубки и замените PBS-EDTA 10 миллилитрами PBS с добавлением 10% FBS. Энергично встряхните тюбик рукой десять раз. Затем дайте ткани осесть на дно пробирки и перенесите надосадочную жидкость в коническую трубку объемом 15 миллилитров с маркировкой Фракция 1. Перемешайте ткани в PBS FBS еще пять раз. Каждый раз перекладывая надосадочную жидкость в новую пробирку фракции. После последнего перемешивания центрифугируйте все образцы и повторно суспендируйте гранулы в пяти миллилитрах предварительно подогретого DMEM/F12 без добавления факторов роста. Теперь снова поверните образцы вниз и отасуньте четыре миллилитра надосадочной жидкости из каждой пробирки. Суспендируйте гранулы в последнем миллилитре оставшейся среды и используйте по 20 микролитров аликвот из каждой фракции, чтобы визуализировать крипты и мусор на предметных стеклах. После объединения соответствующих фракций для достижения наибольшего процентного соотношения крипты к мусору, центрифугируйте объединенные фракции и отсасывайте все, кроме последних 50-100 микролитров надосадочной жидкости. Держа трубки на льду, добавьте 1 миллилитр белковой матрицы к слипшимся фракциям, медленно пипетируя вверх и вниз, чтобы предотвратить добавление пузырьков воздуха. Затем добавьте 50 микролитров суспензии белковой матрицы/крипты в середину каждой лунки из 37