Инъекция Сингенная мышиной меланомы клеток с целью определения их метастатического потенциала в Легких

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать метод производства метастатических опухолей у черных шести мышей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунотерапии, например, как исследовательские агенты влияют на иммунный ответ в легких. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить эксперимент с метастазами.

Таким образом, результаты надежны и относительно последовательны. Для начала поместите культуры клеток меланомы B16-BL6, которые должны иметь конфлюенцию примерно на 70%, в стерильный колпак. Далее добавьте по одному миллилитру 05%-ного трипсина ЭДТА в каждую посуду и оставьте клетки на одну минуту.

После отсасывания этого раствора приступайте к добавлению по одному миллилитру трипсина в каждую тарелку, а затем верните клетки в инкубатор. Через 10 минут переместите клетки в стерильный капюшон и добавьте четыре миллилитра сыворотки RPMI medium на каждую пластину. Затем соберите клетки с помощью стерильной моторизованной пипетки.

Чтобы разбить комки, которые потенциально могут закупорить иглу выброса, прижмите кончик пипетки к нижней части пластины и вытолкните клетки. Повторив этот процесс несколько раз, соберите клетки и перенесите их в 15-миллиметровую коническую трубку. Затем снимают образец клеточной суспензии, вводят его в гемоцитометр и определяют плотность клеток.

Равномерно распределите клеточную суспензию на четыре пробирки по 15 миллилитров. Затем центрифугируйте пробирки, а затем сцедите надосадочную жидкость. Продолжайте маркировать каждую из пробирок с разной плотностью клеток — 0, 0,063, 0,125, 0,25 или 0,5 миллиона клеток на миллилитр.

Затем добавьте соответствующий объем RPMI без сыворотки к каждой конической конику, чтобы получить эти концентрации. Подтвердите желаемую плотность клеток с помощью гемоцитометра. Далее распределите по 500 микролитров каждой суспензии в помеченные 1,8 миллилитровые пробирки, помещенные на лед.

После того как все суспензии клеток B16-BL6 будут приготовлены, выберите мышь. Удерживая его за хвост, направьте животное вперед сзади в удерживающее устройство. Когда туловище мыши находится в основной камере, а ее хвост находится за пределами устройства, продолжайте тянуть животное к концу удерживающего устройства.

Затем вставьте поршень ограничителя и продолжайте нажимать на поршень, пока мышь не будет надежно закреплена. Как только животное окажется на месте, поверните мышь на 90 градусов так, чтобы одна из боковых хвостовых вен была обращена вверх. Затем с помощью спиртовой салфетки энергично очистите ту сторону хвоста мыши, где вена наиболее заметна.

Чтобы подготовиться к инъекции, сначала соберите в шприц 300 микролитров из суспензии 0,5 миллиона клеток на миллилитр. После этого изгоняйте пузырьки из шприца, переворачивая его, щелкая его боком и нажимая на поршень. После удаления пузырьков извлеките клеточную культуру, чтобы получить окончательный объем 250 микролитров в шприце

Продолжайте вытягивать хвост мыши недоминирующей рукой. Держите его так, чтобы указательный палец приподнимал проксимальный конец хвоста, а большой палец надавливал на дистальный отдел. Доминирующей рукой введите иглу в вену по направлению к дистальному концу хвоста под минутным углом вниз.

Затем введите иглу дальше, отрегулировав ее так, чтобы она совпадала с углом наклона хвостовой вены. После того, как игла была введена примерно на один сантиметр в хвостовую вену, начните нажимать на поршень, удерживая шприц неподвижно. Остановите кровотечение, приложив марлю к месту входа.

После того, как клеточная суспензия будет выброшена, извлеките иглу из вены и выбросьте ее. Затем извлеките поршень из ограничителя и поместите мышь в клетку для реципиента. Этот протокол был направлен на определение оптимального количества клеток B16-BL6 для инъекции для создания полезной модели метастатической меланомы.

Здесь показаны экспериментальные очаги, обозначенные стрелками, образовавшиеся в легких через две-три недели после инъекции пяти различных плотностей клеток. Когда вводилось 500 000 клеток на миллилитр, очаги полностью покрывали легкие. В приведенном здесь примере было насчитано 102 очага.

Напротив, легкие были лишь слабо покрыты очагами при введении 62 500 клеток на миллилитр или 125 000 клеток на миллилитр. Соответственно, эти плотности приводили к количеству очагов в легких 1 и 17. С помощью этого метода было определено, что оптимальная концентрация клеток для введения составляет 250 000 клеток на миллилитр.

Такая плотность привела к тому, что в легких было около 65 очагов, в которых органы не были ни полностью покрыты, ни слишком редко покрыты очагами. Дальнейший перечисление этих данных при построении графика демонстрирует приблизительно линейную зависимость между очагами в легких и плотностью клеточных культур выше 125 000 клеток на миллилитр, как показано здесь. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за час, в зависимости от количества мышей, при правильном выполнении.

Пытаясь провести процедуру, важно помнить, что нужно попытаться ввести эквивалентное количество клеток на одну мышь. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как доставка лекарств, чтобы ответить на такие вопросы, как влияние потенциальных методов лечения на ряд результирующих очагов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям рака к изучению составляющих метастатического рака при меланоме у черных шести мышей.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как собирать и препарировать клетки B16-BL6, сдерживать мышей, готовить иглы и вводить эквивалентное количество клеток в каждую хвостовую вену. Не забывайте, что работа с культурой млекопитающих и иглами может быть чрезвычайно опасной, поэтому всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как избегание уколов иглами и ношение защитного снаряжения.