Экспрессия и очистка вирусоподобных частиц для вакцинации

Здесь мы приводим протокол для синтеза вирусоподобных частиц, используя либо бакуловируса или системы экспрессии млекопитающих и очистки ультрацентрифугирования. Этот высоко настраиваемый подход используется для выявления вирусных антигенов в качестве мишеней вакцины в безопасной и гибкой основе.

Общая цель этой процедуры заключается в очистке вирусоподобных частиц, или VLP, экспрессируемых и выделяемых системами экспрессии млекопитающих или насекомых-клеток. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области вакцинации, например, как экспрессировать и очищать конформационно значимые вирусные антигены безопасным и гибким способом. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она не требует осаждения белка с помощью полиэтиленгликоля или подготовки слоев множественной плотности для концентрирования VLP.

Хотя этот метод может дать представление об идентификации вирусных антигенов в качестве мишеней для вакцин, VLP также могут использоваться в качестве инструментов для диагностики заболеваний и серологии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы ресуспензии глицерина в VLP трудно изучить, потому что новички могут не справиться с правильной техникой. В день трансвекции приготовьте растворы липосом и ДНК в соответствии с рекомендациями производителя.

Трансвектируйте клетки ДНК с составом ДНК от одного к одному-двум от HA до NA к Gag и общим количеством ДНК 40 мкг на колбу T150. Повторите этот шаг, чтобы создать девять колб T150, общим объемом 200 миллилитров. Далее разведите растворы ДНК и липосом в бессывороточных трансвекционных средах без антибиотиков, чтобы в каждой колбе содержался общий объем 24 миллилитров.

Верните колбы в инкубатор и сохраняйте клетки и трансвекционную питательную среду до дня сбора вирусоподобных частиц, или VLP. Перенесите надосадочную жидкость в конические пробирки объемом 50 миллилитров, чтобы собрать культуру из клеток через 72-96 часов после трансвекции. Вращайте клетки вниз, чтобы гранулировать клеточный мусор.

Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через заливную мембрану толщиной 0,22 микрона. Культивируют предварительно подготовленные spodoptera frugiperda, или клетки Sf9, в суспензии в колбах для прядения, путем непрерывного перемешивания со скоростью 130 об/мин на многоточечной системе пластин мешалки. Для правильной аэрации поддерживайте объемы культивирования на уровне не более половины объема колбы спиннера.

Затем экспрессируйте CHIK VLP путем заражения 250 миллилитров клеток Sf9 в колбе с плотностью от двух до десяти до шести клеток на миллилитр предварительно приготовленным рекомбинантным бакуловирусом, и верните клетки в инкубатор с температурой 28 градусов Цельсия. Используйте исключение трипанового синего, чтобы определить, снизилась ли жизнеспособность клеток до 70–80%. После подтверждения перенесите культуры непосредственно из суспензии в конические пробирки объемом 50 миллилитров и раскрутите клетки вниз. Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте их через заливную мембрану толщиной 0,22 микрона перед осаждением.

Стерилизуйте шесть ультрацентрифужных пробирок размером 25 мм на 89 мм с открытым верхом с 70% этанолом. Затем убедитесь, что этанол полностью высох. Загрузите в чистые пробирки 32 миллилитра надосадочной жидкости.

Далее тщательно подложите надосадочную жидкость с тремя миллилитрами стерильного 20%-го глицерина и PBS. Наносите глицерин медленно, чтобы избежать разрушения тонкого слоя плотности между глицерином и раствором VLP. Слишком быстрое дозирование глицерина приведет к смешиванию глицерина и растворов VLP, что уменьшит осаждение VLP.

Убедитесь, что трубки сбалансированы, затем начните вращение. Через четыре часа извлеките пробирки из центрифуги. Отсасывайте надосадочную жидкость, стараясь не выбить гранулу из трубки.

Ресуспендируйте осажденные VLP в количестве не менее 100 микролитров на дне пробирок со стерильным PBS путем осторожного и медленного пипетирования вверх и вниз. Ресуспендию гранулы VLP следует проводить с щадящей, медленной повторной аспирацией и вытеснением PBS с помощью пипетки. Избегайте образования пузырей, чтобы ограничить потери VLP.

Наконец, храните ресуспендированные VLP. Объемы VLP и общий выход белка из обычного анализа BCA были получены из различных конструкций SVP и VLP. Выход CHIK SVP из клеток Sf9 колеблется от 0,008 до 0,016 мг общего белка на миллилитр объема надосадочной жидкости.

В то время как производство 293 Т-клеток млекопитающих приводит к десятикратному снижению белка. Это изображение с помощью электронного микроснимка показывает, что VLP ядра HA Gag гриппа успешно экспрессируются, собираются и очищаются в виде VLP. Что ж, при попытке провести эту процедуру важно помнить, что трансвектировать и заражать только здоровые и жизнеспособные клеточные культуры, так как это повлияет на общий уровень экспрессии белка.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализы BCA, ELIZA и HA, для измерения общего содержания белка, специфического содержания антигена и экспрессии функциональной ГК. Не забывайте, что работа с ультрацентрифугой может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать такие меры предосторожности, как балансировка пробирок, использование только рекомендованных роторов и скоростей, а также надлежащий надзор за новым персоналом лаборатории.