Один шаг Отрицательный хроматографической очистки

Общая цель данной очистки заключается в получении функционального нейтрофил-активирующего белка Helicobacter pylori (HP-NAP) в его нативной форме с высокой степенью чистоты и выходом, используя периодическую хроматографию в режиме негативной селекции с применением диэтиламиноэтильной ионообменной смолы. Основным преимуществом данного метода является возможность одностадийной очистки HP-NAP в нативной форме с высоким выходом и чистотой. Негативная очистка HP-NAP начинается с процедуры пакетного связывания, при которой фракция растворимых белков из бактериальных лизатов добавляется к смоле DEAE.

Смесь инкубируют для связывания белков с сорбентом. Затем HP-NAP, присутствующий в несвязавшейся фракции, выделяют путем центрифугирования или гравитационного фильтрования. Данный метод имеет важное значение для профилактического лечения в соотношении 10:1 и прогнозирования заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori, а также для терапии рака.

Это обусловлено иммуногенными и иммуномодулирующими свойствами HP-NAP. Как правило, специалисты, впервые использующие данный метод, сталкиваются с определенными трудностями, так как HP-NAP легко агрегирует в процессе стерилизации.

Процедуру продемонстрирует Чжи-Вэй Хун, аспирант нашей лаборатории. Работая при температуре 4 °C, мы суспендируем 50 мл клеточного осадка, приготовленного согласно текстовому протоколу, в 20 мл низкосолевого Трис-буфера с pH 9,0 и смесью ингибиторов протеаз. Критически важно поддерживать температуру образца на уровне 4 °C, чтобы предотвратить агрегацию белков в ходе процедуры.

Разрушьте бактериальные клетки, пропуская бактериальную суспензию через гомогенизатор высокого давления при давлении от 15 000 до 20 000 PSI семь раз при температуре 4 °C. После получения лизатов следует немедленно провести центрифугирование. Перенесите гомогенизированные образцы в центрифужную пробирку.

Немедленно центрифугируйте клеточный лизат в ультрацентрифуге при 30,000 ×g при температуре 4 °C в течение одного часа для разделения растворимой и нерастворимой белковых фракций. После центрифугирования перенесите супернатант, представляющий собой растворимую белковую фракцию, в стакан. Определите концентрацию белка в растворимой фракции методом Брэдфорда с использованием коммерческого набора и бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта в соответствии с инструкциями производителя.

Затем добавьте 177,6 µL 1N HCl в 20 mL фракции растворимого белка, чтобы довести значение pH с 9,0 до 8,0. Добавьте в белковый раствор 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 50 мМ NaCl, чтобы конечная концентрация белка составила 0,5 mg/mL. Для подготовки 15 mL смолы DEAE суспендируйте 0,6 g сухого порошка смолы DEAE в 30 mL буфера Tris-HCl при комнатной температуре минимум на один день.

Центрифугируйте смолу при 10 000 ×g при температуре 4 °C в течение одной минуты, затем удалите и утилизируйте супернатант. После этого добавьте 15 мл буфера Tris-HCl. Повторив этапы центрифугирования и ресуспендирования еще четыре раза, храните 15 мл осажденной смолы при температуре 4 °C для последующего использования.

Работая при температуре 4 °C, добавьте 45 мл подготовленных растворимых белков к миллилитрам смолы и перенесите смесь в стакан объемом 100 мл с магнитным якорем. Перемешивайте суспензию белка и смолы на магнитной мешалке при температуре 4 °C в течение одного часа. Затем перелейте суспензию белка и смолы в пластиковую или стеклянную колонку, оснащенную краном, и дайте смоле осесть под действием силы тяжести.

Откройте кран, чтобы белковый раствор прошел через колонку под действием силы тяжести, пока уровень жидкости в колонке не окажется чуть выше смолы. Соберите прошедшую фракцию как несвязавшуюся фракцию, содержащую очищенный нейтрофил-активирующий белок. Добавьте в колонку 15 milliliters ледяного буфера Tris-HCl.

Снова откройте кран, чтобы промывочный буфер протек через колонку под действием силы тяжести до тех пор, пока уровень жидкости в колонке не окажется чуть выше смолы. Соберите прошедшую жидкость в качестве промывочной фракции. Повторите промывку ледяным буфером еще четыре раза для сбора дополнительных промывочных фракций.

Затем добавьте в колонку 15 миллилитров ледяного 20 миллимолярного Tris-HCl pH 8.0 с 1 молярным хлоридом натрия. Соберите прошедшую жидкость в качестве элюированных фракций, как и прежде. Повторите этапы элюции еще четыре раза для сбора дополнительных элюированных фракций.

Здесь показано влияние pH на растворимость HP-NAP в лизате E.coli. Количество HP-NAP, обнаруженного в этой растворимой фракции, заметно увеличивалось при pH от 7,5 до 9,5. Рекомбинантный HP-NAP был почти полностью восстановлен в растворимой фракции при лизисе клеток при pH 9,0.

Здесь показано влияние pH на отрицательную очистку рекомбинантного HP-NAP, экспрессированного в E.coli, с помощью смол DEAE в периодическом режиме. При pH 8.0 в элюированной фракции присутствовало лишь небольшое количество HP-NAP. Наибольшее количество HP-NAP в несвязавшихся фракциях наблюдалось при pH 8.0.

Оптимальное количество белков, наносимых на смолу DEAE, составляет 1.5 мг белка на мл смолы для достижения максимальной емкости сорбента по поглощению примесей из E.coli. При pH 8.0 в несвязанной фракции при использовании смол DEAE в режиме периодического процесса восстанавливается очень мало белков, кроме HP-NAP в его нативной форме. Чистота HP-NAP превысила 95%.

Очищенный HP-NAP формирует мультимер со вторичной структурой в виде альфа-спирали, что подтверждается хроматограммой гельфильтрации и спектром кругового дихроизма в дальнем УФ-диапазоне. Анализ хемилюминесценции, зависящий от просвета, показывает, что очищенный HP-NAP способен индуцировать выработку активных форм кислорода нейтрофилами. После освоения данные методы могут быть выполнены в течение пяти часов при условии их правильного проведения.

После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как очищать функциональный HP-NAP в его нативной форме с высоким выходом и степенью чистоты, используя пакетную хроматографию в негативном режиме с применением DEAE и ионообменной смолы. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использования буферов с соответствующим pH на этапе стерилизации при пакетной хроматографии. Идея этого метода возникла у нас, когда мы попытались применить другие хроматографические подходы вместо фильтрации для очистки HP-NAP в его нативной форме.

Хотя данный метод разработан для очистки рекомбинантного HP-NAP, экспрессированного в E.coli, он также может быть применен к другим бактериальным системам экспрессии, таким как per-sida sep-tidas. Визуальная демонстрация этой процедуры представлена в кратком виде.

Кроме того, этапы стерилизации и пакетной хроматографии трудно освоить, поскольку эти операции должны выполняться при температуре 4 °C без каких-либо временных задержек. Если белок, предназначенный для очистки, подходит для нашего ионообменного хроматографического разделения в режиме исключения, данную процедуру также можно адаптировать в качестве отправной точки для разработки процесса очистки.

После своей разработки данный метод открыл перед исследователями в области клинических исследований возможности изучения применения HP-NAP в терапии рака, а также разработки вакцин, лекарственных средств и методов диагностики заболеваний, связанных с Helicobacter pylori.