Формирование гигантского размера Polymersomes гель-регидратация при содействии

Общая цель этого метода гелевой регидратации заключается в надежном формировании неповрежденных однослойных гигантских полимерных везикул, в которых можно легко контролировать распределение везикул по размерам. Этот метод предлагает надежную альтернативу для формирования полимерных везикул, которые могут быть использованы для исследования физических свойств мембраны, а затем интегрировать эти везикулы в биоинженерные приложения. Основным преимуществом этой методики является возможность легко производить сотни неповрежденных гигантских полимерных везикул гораздо быстрее и менее трудоемким способом, чем при традиционных методах.

Идея для этого возникла, когда мы узнали о методе гелевой регидратации для формирования гигантских липидных пузырьков. Однако наши нынешние методы формирования гигантских полимерсомов сложны и часто малопродуктивны, поэтому мы решили использовать эту методологию в качестве альтернативного подхода. Начните приготовление полимерного раствора, взболтав пять миллиграммов диблок-сополимера PEO-PBD в одном миллилитре хлороформа в стеклянном флаконе до полного растворения.

Добавьте пять миллиграммов на миллилитр раствора полимера и хлороформа и один миллиграмм на миллилитр раствора флуоресцентно меченного липида и хлороформа в новый флакон до получения конечной концентрации 99,5 моль полимера и 0,5 процента липида. Чтобы свести к минимуму испарение, переложите полимерный раствор в герметичный флакон с крышкой, устойчивой к хлороформу, и храните его при температуре 20 градусов Цельсия для последующего использования. Для начала приготовления агарозной пленки в колбу Эрленмейера объемом 50 миллилитров добавьте 50 миллилитров воды и 0,5 грамма стандартной агарозы.

Варите одну минуту с помощью микроволновой печи. Прежде чем продолжить, охладите раствор агарозы до 65-75 градусов Цельсия, чтобы предотвратить плохую адгезию или комкование. Затем отрежьте конец наконечника для пипетки объемом 1000 микролитров и с его помощью нанесите 300 микролитров раствора агарозы на крышку квадратного стекла объемом 25 миллилитров.

Надев перчатки, возьмитесь за край накладки и равномерно распределите агарозу по всей поверхности с помощью длинного края еще одного наконечника для пипетки объемом 1000 микролитров. Поместите крышку агарозной стороной вверх на парапленку и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия не менее одного часа. Продолжайте пипетированием 30 микролитров ранее приготовленного полимерного раствора на покрытый агарозной пленкой покровный лист.

Возьмитесь за скользящий край крышки пальцами в перчатках и распределите полимерный раствор по агарозной пленке круговыми движениями с помощью длинного края иглы 18 калибра. В завершение поместите крышку скользящей полимерной стороной вверх в пластиковую чашку Петри внутри вакуумного эксикатора. Откачайте эксикатор не менее чем на один час, чтобы удалить остатки растворителя.

Чтобы сформировать полимерсомы, сначала хорошо приклейте крышку к полимерной стороне защитного стекла с покрытием, осторожно надавливая до образования плотного уплотнения. Затем добавьте в камеру от 200 до 500 микролитров регидратационного раствора. Затем поместите влажную свернутую лабораторную салфетку вдоль внутреннего края стеклянной чашки Петри, чтобы образовалась камера влажности.

Поместите крышку с приклеенной крышкой хорошо в блюдо и накройте ее крышкой. Накройте чашку Петри фольгой, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание, а затем установите ее на горячую плиту при температуре 40 градусов Цельсия не менее чем на 30 минут для завершения формирования полимера. Чтобы начать процесс визуализации FRAP, поместите защитное стекло с приклеенной крышкой на предметный столик инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного регулируемым конденсором.

Затем выберите набор фильтров на основе используемого флуоресцентного липида и изобразите полимерсомы на верхней поверхности защитного стекла с помощью масляного объектива 100X. Чтобы охарактеризовать текучесть мембраны с помощью FRAP, сначала сфокусируйтесь на полимерсоме, затем закройте конденсор микроскопа до небольшой апертуры и убедитесь, что края полимерсомы находятся в поле изображения. Затем увеличьте экспозицию камеры, снимите все фильтры нейтральной плотности и дайте интересующей области фотообесцвечиваться в течение 30-60 секунд.

Наконец, выключите лампу и полностью откройте конденсатор. Уменьшите экспозицию до начальных настроек и делайте снимки каждые 30 секунд в течение трех минут. Откройте программное обеспечение для анализа изображений на компьютере микроскопа и загрузите полученные изображения полимерсом.

Установите масштаб для измерения, открыв раскрывающееся меню «Анализ» и выбрав параметр «Установить масштаб». Введите соответствующие калибровочные единицы для расстояния в пикселях, известного расстояния и единицы длины, а затем нажмите кнопку ОК. Затем используйте набор инструментов для линий и нарисуйте линию, охватывающую диаметр выбранной полимерсомы.

Измерьте диаметр полимерсомы, открыв раскрывающееся меню «Анализ» и выбрав «Измерить». Чтобы облегчить анализ, используйте control plus D для печати измерительной линии на изображении перед переходом к следующему полимерсому. Продолжайте измерять полимерсомы, используя описанную выше процедуру, и добавляйте каждое измерение в окно данных до полного завершения.

Наконец, сохраните данные, нажав «Файл» и «Сохранить как».Нажмите «Сохранить» в открывшемся окне, а затем откройте файл результатов в виде электронной таблицы для анализа данных. Полимерсомы, образованные из полимерных пленок PEO-PBD, регидратированных различными буферами, визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Изображения показывают, что полимерсомы имеют неоднородный размер при различных условиях регидратации и обычно имеют диаметр менее 10 микрометров.

Эпифлуоресцентные изображения полимерсом, образовавшихся в воде при различных температурах, показывают, что по мере повышения температуры регидратации образуются более крупные полимерсомы. Рассчитаны средние диаметры более 100 полимерсом, образующихся в воде при различных температурах регидратации. При температуре 24 градуса Цельсия средний диаметр составлял 2,93 микрометра, увеличиваясь до 14,04 микрометра при 70 градусах Цельсия.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за один час при правильном выполнении. При попытке выполнить эту процедуру важно постоянно держать полимерсомы в растворе. Убедитесь, что колодец крышки надежно прикреплен к защитному стеклоу, чтобы избежать утечки раствора регидратации и высыхания полимерсом.

После этой процедуры можно использовать такие методы, как электронная микроскопия, чтобы понять дополнительные структурные свойства полимерсом. Этот метод прокладывает путь для исследований в области синтетической биологии и биоинженерии для изучения полимерсомов в качестве надежной, химически адаптированной альтернативы липидным мембранам для исследований и абиотико-биотического интерфейса, исследований доставки лекарств и протоклеточных систем. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как надежно формировать гигантские полимерсомы с помощью гелевой регидратации, настраивать общий размер везикул и характеризовать целостность их мембран

Не забывайте, что работа с хлороформом или агарозой и хвоей может быть опасной. Будьте внимательны при выполнении этих процедур. Примите меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу, и всегда используйте очки и перчатки.