Микроинъекция для Трансгенез и редактирования генома в трехиглой колюшками

Общая цель этой техники микроинъекций заключается в создании трансгенных и отредактированных в геноме рыб колюшки для тестирования функций гена и энхансера. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эволюции и эволюционной генетики, например, как функционируют гены и энхансеры для создания паттерна тела. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она эффективно генерирует трансгенных рыб для функционального генетического анализа.

После подготовки толлинга двух плазмид и мРНК согласно текстовому протоколу вытащите не менее четырех игл микропипетки из боросиликатного стекла. Храните вертикально в капиллярной банке для хранения, острые концы которой обращены вниз. Чтобы оплодотворить до ста яиц колюшки, добавьте 50 микролитров раствора сперматозоида и осторожно перемешайте наконечником пипетки, чтобы убедиться, что все яйца оплодотворены.

Во время работы на льду заполните не менее трех игл, впрыснув 0,5 микролитра раствора для инъекций в тупой конец иглы и дайте ему стечь. Тем временем включите свет для транслюминации для препарирующего микроскопа и поместите стеклянную пластину площадью 13 квадратных сантиметров на световое основание микроскопа с 15-сантиметровым гипсовым пильным полотном поверх стеклянной пластины. Расположите пилу перпендикулярно инъекционному аппарату углублениями по направлению к иглодержателю, затем включите блок управления и убедитесь, что давление установлено примерно на 175 килопаскалей.

Установите продолжительность инъекции равной 180 миллисекундам. Затем ослабьте иглодержатель, затем вставьте заполненную иглу в держатель до тех пор, пока сопротивление резинового держателя не станет ощутимым, и затяните иглодержатель до упора пальца. Затем отрегулируйте угол наклона иглы примерно до 45 градусов.

С помощью элементов управления микроманипулятором отрегулируйте иглу так, чтобы конец был центрирован в поле зрения. Увеличьте масштаб примерно до 40-кратного увеличения и сфокусируйтесь на кончике иглы, который не должен касаться стекла внизу. Часовыми щипцами возьмитесь за кончик иглы шириной в два-три щипца от конца и аккуратно сломайте кончик под углом 60 градусов.

Затем нажмите на ножную педаль инъекции несколько раз, чтобы проверить, не сломана ли игла. После нескольких нажатий из конца должны начать выходить крошечные красные капельки. С помощью одноразовой переводной пипетки нанесите несколько капель колюшки воды на стеклянную пластину.

Осторожно опустите иглу в воду, затем увеличьте противодавление, пока из иглы не выйдет слабая струйка розовой жидкости. Втяните иглу как можно дальше, чтобы она не была повреждена во время подготовки эмбрионов. Примерно через 25 минут после оплодотворения с помощью двух наконечников пипетки объемом 10 микролитров удалите от пяти до 10 эмбрионов из кладки и перенесите их на стеклянную пластину.

С помощью наконечников пипетки аккуратно разделите зародыши на отдельные углубления пильного полотна, соблюдая осторожность, чтобы не проколоть зародыши. Далее с помощью переводной пипетки добавьте достаточное количество воды, чтобы покрыть зародыши. Затем через три-пять секунд удалите большую часть воды, оставив только небольшой объем, покрывающий каждый эмбрион.

Начиная с самого дальнего эмбриона, сдвиньте стеклянную пластину и увеличьте масштаб эмбриона так, чтобы он заполнил примерно 25 процентов поля зрения. Опустите иглу в поле зрения, затем с помощью кончика пипетки объемом 10 микролитров осторожно поверните эмбрион, чтобы определить бластомер, зернистый, слегка желтый, приподнятый бугорок цитоплазмы на верхней части желтка. Поверните зародыш так, чтобы бластомер находился прямо перпендикулярно концу иглы.

Опустите иглу, медленно и равномерно надавливая, чтобы проколоть корион, и введите иглу в цитоплазму, не проталкивая ее через нижележащий желток. Нажмите на ножную педаль три-четыре раза для инъекции так, чтобы красный болюс со слегка размытыми краями заполнил примерно 1/8 диаметра цитоплазмы. Наличие острой иглы, перпендикулярной кориону, облегчит этот этап.

Ограничение количества добавляемой воды поможет сохранить корион мягким. И, наконец, нацеливание на цитоплазму повысит вероятность получения трансгенного животного. Используйте элементы управления микроманипулятором, чтобы втянуть иглу, и с помощью наконечника пипетки объемом 10 микролитров удерживайте эмбрион, если он прилипает к игле.

После втягивания иглы сдвиньте стеклянную пластину, чтобы выровнять следующий эмбрион с иглой, и повторите инъекцию. Когда все эмбрионы будут введены, используйте трансферную пипетку с отрезанным концом, чтобы добавить воду в тарелку. Затем с помощью трансферной пипетки соберите эмбрионы и поместите их в 150-миллиметровую чашку Петри, наполненную водой из колюшки.

Инкубируйте эмбрионы при температуре 18 градусов Цельсия. Через сутки после инъекции аккуратно слейте с колюшки воду и замените ее свежей водой. Проверьте наличие мертвых или уродливых эмбрионов и удалите их, чтобы предотвратить заражение.

Как показано здесь, для трансгенов, обладающих энхансерной активностью, успешная инъекция приводит к специфической клеточной экспрессии трансгена. Например, в грудном и срединном плавниках и хорде. Затем введенную рыбу можно скрещивать для получения стабильных линий, таких как эта обратная стабильная линия, которая стимулирует экспрессию GFP в эмбриональном сердце через четыре дня после оплодотворения.

Что касается активного энхансера, то от 40 до 50 процентов эмбрионов будут демонстрировать тканеспецифическую экспрессию трансгенов, например, в срединном и грудном плавниках. До 100 процентов GFP-положительных рыб F0, экспрессирующих два плазмидных трансгена, производят трансгенное потомство. Тем не менее, процент потомства, несущего трансген, колеблется в широких пределах от менее чем одного процента до 72 процентов.

Сохранение только GFP-положительных эмбрионов, как правило, повышает эффективность передачи. Только до 10 процентов эмбрионов колюшки, введенных F0, проявляют флуоресценцию в ожидаемых тканях. Кроме того, скорость передачи у спин ниже, чем у плазмидных конструкций.

Только до 14 процентов просеянных колюшек передают обратно. В отличие от низкой эффективности обратного трансгенеза, от 70 до 100 процентов рыб, которым вводили когти, имеют мозаичные поражения. Здесь неразрезанный ампликон ПЦР в каждом из введенных эмбрионов указывает на то, что некоторые клетки в каждом эмбрионе несут поражения в целевом локусе.

После освоения этой техники ее можно выполнить чуть более чем за час для кладки из 100 эмбрионов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что для улучшения техники и выживаемости эмбрионов требуются практика и терпение. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как конфокальная микроскопия, чтобы ответить на дальнейшие вопросы о подробных паттернах экспрессии энхансеров.

Кроме того, отредактированные геномные рыбы могут быть выращены в скрещивании для изучения фенотипов, возникающих в результате индуцированных мутаций. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области эволюционной генетики и генетики развития к изучению регуляции и функции генов у колюшки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как вводить эмбрионы колюшки для трансгенеза и редактирования генома.