Multi-фермента скрининга с использованием высокой пропускной Генетическая ферментного Screening System

Общая цель данной методологии заключается в оценке нескольких ферментов с использованием одной высокопроизводительной системы скрининга. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроорганизмов и биоинженерии о метагеномном скрининге и ферментной инженерии. Мы разработали систему скрининга генетических ферментов, которая состоит из мутантного соединения фенилена MPL и его репортера GFP.

Как только какой-либо метагеномный ген проявляет интересующую нас ферментативную активность, реагируя с предоставленным субстратом, фениленовое соединение продукта реакции активирует Dmp-мутант и запускает экспрессию репортера GFP, которая может быть легко зафиксирована флуоресцентным метром. Основное преимущество этого метода заключается в том, что в отличие от обычных методов скрининга, этот единственный метод применим для скрининга нескольких типов различных ферментов с использованием соответствующего субстрата. Демонстрировать эту процедуру будет Кил Коанг Квон, аспирант нашей лаборатории.

После создания метагеномной библиотеки в E.Coli с помощью фосмидного вектора с использованием набора для производства библиотеки фосмида, транспортируйте ДНК pGESS(E135K) в клетки метагеномной библиотеки. Затем храните трансформированные библиотечные ячейки при температуре минус 70 градусов Цельсия и 20 микролитровых аликвотах. Чтобы удалить ложноположительные результаты, сначала разморозьте аликвоту метагеномной библиотеки клеток на льду.

Затем введите десять микролитров размороженных клеток в два миллилитра лизогенатного бульона, содержащего ампициллин и хлорамфеникол, в 14-миллилитровую пробирку с круглым дном при температуре 37 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту в течение четырех часов. Тем временем установите соответствующие параметры на машине FACS для чтения ячеек метагеномной библиотеки в программном обеспечении FACS по умолчанию. В конце инкубации перенесите пять микролитров клеток в один миллилитр PBS в пятимиллилитровую пробирку с круглым дном.

Затем загрузите образец разбавленной библиотеки и настройте частоту событий до 1000–1500 событий в секунду. Чтобы создать логарифмическую прямую область рассеяния против логарифмической боковой точечной диаграммы на глобальном листе, создайте точечную диаграмму и нарисуйте полигональный вентиль вокруг синглетных событий, содержащих бактериальную популяцию. Чтобы построить график зависимости числа ячеек от гистограммы площади FITC в логарифмическом масштабе, откройте гистограмму и настройте напряжение FITC таким образом, чтобы пик колоколообразного распределения составлял менее десяти к двум областям FITC.

Затем откройте еще одну точечную диаграмму, чтобы создать логарифмически масштабированную область прямого рассеяния против логарифмической диаграммы FITC-площади и установите сортировочный гейт R2 между плюсом пятью и минус пятью процентами ячеек от центра распределения. Когда все ворота будут установлены, поместите пробирку для сбора, содержащую 1,2 миллилитра бульона лизогената с добавлением антибиотика, на выходное отверстие инструмента FACS и отсортируйте от одного раза до десяти-шестой клеток в бульоне. В конце сортировки закупорьте пробирку для сбора и аккуратно закрутите ячейки.

Для скрининга представляющих интерес метагеномных ферментов инкубируйте отсортированные клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,5, затем добавьте один микролитр раствора для индукции копий для амплификации внутриклеточного числа фосмидов. Через три часа при температуре 37 градусов Цельсия и 250 оборотах в минуту соедините 0,5 миллилитра клеток с подходящим субстратом в 14-миллилитровой пробирке с круглым дном до конечной концентрации 100 микромолей. Затем инкубируют контрольные и экспериментальные образцы при температуре 37 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту еще три часа.

Пока образцы встряхиваются, установите параметры машины FACS, как показано выше. Затем добавьте пять микролитров клеток из каждого образца в отдельные пятимиллилитровые пробирки с круглым дном, содержащие один миллилитр PBS. Затем загрузите образцы ячеек и установите частоту событий от 1000 до 3000 событий в секунду.

Создайте логарифмическую прямую область рассеяния против логарифмической боковой области рассеяния и настройте затвор рассеяния R1 так, чтобы он охватывал бактериальные клетки с синглетным событием. Затем создайте логарифмически масштабируемую прямую диаграмму рассеяния в сравнении с логарифмически масштабируемой диаграммой рассеяния FITC и установите сортировочный вентиль R2 таким образом, чтобы было обнаружено менее 0,1% отрицательных ячеек. Теперь загрузите пробирку с образцом и при необходимости отрегулируйте частоту событий до 1000–3000 событий в секунду.

Затем поместите пробирку для сбора, содержащую 0,5 миллилитра бульона лизогената, на выходе из прибора FACS и соберите один раз в десять-четвертую части клеток внутри затворов R1 и R2. Когда все клетки будут изолированы, закройте пробирку для сбора и аккуратно закрутите клетки. Затем распределите 0,5 миллилитра собранных образцов на две 90-миллиметровые агаровые пластины, содержащие лизогенатный бульон, дополненный антибиотиками, затем инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На этом рисунке показан продемонстрированный протокол скрининга, включающий устранение ложноположительных результатов с помощью отрицательной сортировки и отбор положительных попаданий с использованием сортировочных вентили R1 и R2. Затем попадания могут быть оценены путем сравнения цветущего образца с субстратом и без него. В этом репрезентативном скрининге, опосредованном p-нитрофлией ацетатом, цветение клеток, обработанных субстратом, было выше, чем у контрольных клеток, что подтверждает пять кандидатов в липазы в этом эксперименте.

Несмотря на широкое распространение этих трех кандидатов в целлюлозы, наблюдаются явные различия в средней интенсивности FITC в популяциях. Эти четыре кандидата в фосфатазы также демонстрируют высокие уровни флуоресценции по сравнению с контрольными клетками. Кроме того, щелочная фосфатазная активность инкордированных векторов может быть подтверждена с помощью проточной цитометрии с более сильным сигналом флуоресценции, наблюдаемым для пораженного фермента, чем для клеток, несущих пустую плазмиду.

Важно помнить, что этот метод может быть применен для скрининга широкого спектра ферментов путем выбора подходящего субстрата и концентрации в рационе. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование нового поколения, чтобы ответить на дополнительные вопросы об идентификации и характеризации фермента-кандидата высокопроизводительным способом. После своего развития этот высокопроизводительный метод ферментного скрининга проложил путь исследователям в области ферментной инженерии к изучению различных метагеномных ферментов без необходимости ферментной специфичности.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать высокопроизводительную систему скрининга на основе метогенного контура с широким диапазоном ферментов-мишеней.