Проектирование и разработка аптамеров-Gold наночастицу Based колориметрического анализа для В полевых условиях приложений

Общая цель — предложить общий подход к разработке колориметрического анализа на основе наночастиц на основе аптамер-золота для обнаружения целевых молекул, а также предложить подходы для улучшения долгосрочного хранения и снижения вероятности ложноположительных результатов. Этот метод отвечает на ключевые вопросы в области колориметрических анализов на наночастицы золота, такие как воспроизводимость тестов в поле для длительного хранения и снижение вероятности ложноположительных результатов. Такие анализы могут вызывать проблемы с сроком годности и ложноположительные результаты.

В этой работе мы улучшаем оба эти вопроса. Очистите 500-миллилитровую колбу Erlenmeyer и большую батончик для перемешивания пятью миллилитрами концентрированной азотной кислоты и 15 миллилитрами концентрированной соляной кислоты в химической защитной вытяжке. Смочите всю поверхность колбы кислотным промывкой.

Затем промыть флягу водой без нуклеазы и дать ей высохнуть. Добавьте 100 миллилитров одного миллимолярного золота три хлорида. Используйте лист алюминиевой фольги, чтобы накрыть верхнюю часть кислотно очищенной колбы Erlenmeyer и нагрейте с непрерывным помешиваниям на горячей плите до кипятения.

Затем добавьте 10 миллилитров 38,8-миллимолярного натрия цитратa. Цвет меняется с прозрачного или серого на тёмно-синий или чёрный, а затем на тёмный на красный за несколько минут. Продолжайте помешивать с выключенным огнём в течение 10 минут.

Дайте золотой наночастице остыть до комнатной температуры и добавьте 110 микролитров DEPC с непрерывным перемешиванием. Накройте всю колбу алюминиевой фольгой и дайте обработке DEPC инкубироваться на ночь. На следующий день — автоклав золотой наночастиц.

Затем остудиться до комнатной температуры и профильтровать через мембрану из ацетата из поровой целлюлозы толщиной 0,22 микрона. Храните фильтрованный, автоклавированный раствор золотых наночастиц в темноте при температуре четырёх градусов Цельсия. Вычислите концентрацию золотых наночастиц, как описано в текстовом протоколе.

Здесь концентрация была рассчитана как 10 наномоляров с размером 15 нанометров, определённой динамическим рассеянием света. Приобрести или синтезировать последовательности аптамеров, связывающих кокаин, используя стандартную химию фосфорамидитов. После очистки аптамеров стандартным обезсолением восстанавливают олигонуклеотиды в безнуклеазной воде в растворах 100 микромоляров или один миллимолярный запасной раствор.

Аликотированные очищенные аптамеры можно хранить при 20 градусах Цельсия в течение нескольких месяцев. Комбинируйте ДНК с раствором наночастиц золота с 10 наномолярами, изменяя объём наночастиц золота по желаемости, чтобы получить достаточно образца для проведения теста. Инкубировать смесь в течение трёх-четырёх часов при комнатной температуре и защитить от света.

Добавьте равный объём 20 миллимолярных HEPES, два миллимолярных хлорида магния и буфер pH 7,4, и разместите образец при температуре четырёх градусов Цельсия в темноте на ночь. Начальная концентрация соли, необходимая для индуцирования цветовой реакции анализа с помощью титрации соли, определяется с помощью тест-бланка. Добавьте 20 микролитров метанола в 180-микролитровые аликвоты анализа аптамер-золотого хлорида в пластине на 96 лунок.

Критическим этапом в выполнении этих тестов является определение концентрации хлорида натрия для дестабилизации золотых наночастиц после добавления мишени. Титруйте образцы с увеличением объёма стандартного раствора хлорида натрия и определите точку эквивалентности. Здесь определите объём хлорида натрия, необходимый для малейшего изменения цвета при визуальном наблюдении.

Оптимизируя отклик анализа, добавьте 20 микролитров молекул анализа, разбавленных метанолом, к 180-микролитровым аликвотам анализа наночастиц аптамер-золота в пластине с 96 лунками при комнатной температуре. Сразу же добавьте концентрацию хлорида натрия, определённую на предыдущем этапе, чтобы инициировать цветовой реакцию анализа. Получить максимальное изменение цвета, увеличив или уменьшив концентрацию хлорида натрия и сравнив целевой реакцию с пустым ответом.

Используйте концентрацию хлорида натрия, которая обеспечивает наибольшую разницу в отклике. Наблюдайте или измеряйте реакцию анализа через 150 секунд после добавления хлорида натрия. Проанализировать поглощение на 650 нанометрах и 530 нанометров с помощью спектрофотометра.

Отметьте результаты как отношение поглощения, полученное на 650 нанометрах и 530 нанометров, в зависимости от концентрации анализируемого вещества. Нормализуйте реакцию анализа на пустой сигнал. Подготовьте компоненты анализа наночастиц аптамер-золота, как описано ранее в видео.

Сделайте отдельные растворы, содержащие один грамм трегалозы на миллилитр и один грамм сахарозы на миллилитр сахарозы в воде без нуклеаз, чтобы получить криогенный раствор. Таким образом, критически важным этапом при заморозке этих анализов является определение количества растворов трегалозы и сахарозы добавить в образцы, чтобы обеспечить полное и равномерное замораживание. Приготовьте раствор, содержащий 19,2 миллиграмма на миллилитр трегалозы и 4,8 миллиграмма сахарозы с помощью анализа наночастиц 60 MN4 на золото при итоговом объёме 200 микролитров в микроцентрифугных трубках объемом 1,5 миллилитра.

Конечные концентрации раствора криогена будут зависеть от покрытия ДНК. Пробы быстро заморозьте с помощью морозильника при температуре 146 градусов Цельсия или в жидком азоте. Храните образцы замороженные до использования.

Для этой работы оставьте образцы в морозильнике при 146 градусах Цельсия на ночь, а затем перенесите в морозильник при 20 градусах Цельсия для длительного хранения. Здесь показаны репрезентативные результаты кривых титрации хлорида натрия для необработанных и обработанных ДНК-аптамером золотых наночастиц. Начальная концентрация хлорида натрия, использованная в анализе, определялась титрированием.

Здесь представлены представительные результаты колориметрического анализа наночастиц с аптамером и золотом для кокаина и контрольных молекул. Графики показывают влияние увеличения плотности покрытия ДНК на уровень ложноположительных результатов анализа кокаина. Здесь показаны графики калибровочных кривых, полученные с помощью фотоанализа колориметрического анализа кокаина.

Фотографии, полученные с помощью смартфонов. Здесь представлены репрезентативные результаты анализного ответа на наночастицы на наночастицах на кокаиновые и контрольные молекулы. Данные сравнивают только что подготовленные образцы с образцами, хранящимися замороженными до четырёх недель.

При проведении этой процедуры крайне важно определить правильную концентрацию хлорида натрия для дестабилизации золотых наночастиц и стимулирования типичного изменения цвета при добавлении мишени. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как разрабатывать колориметрические анализы аптамера золотых наночастиц для обнаружения интересующих целей. Вы можете использовать приведённые здесь методы, чтобы снизить уровень ложноположительных ответов и сохранить жизнеспособность анализов более месяца.