Быстрая проверка Терминаторов Используя ПГР-голубой плазмид и Золотые ворота в сборе

Общая цель протокола синтетической биологии заключается в быстром определении функциональности терминатора и количественной оценке его прочности в системе in vitro, в которой используется сборка золотых ворот. Этот протокол используется для тестирования терминаторов, которые мы нашли in silico с помощью биоинформатики, и их тестирования в биологических условиях. Это позволяет быстро и просто подтверждать биоинформатически идентифицированные терминаторы в лабораторных условиях.

Главным преимуществом этого протокола является его скорость. Мы можем перейти от биоинформатической идентификации к биологическому подтверждению менее чем за одну неделю. И при этом мы также можем проверить, что терминатор на самом деле является терминатором, и мы можем количественно оценить его терминирующую силу.

Как правило, люди поначалу будут испытывать трудности с этим методом, потому что добавление фермента рестрикции с лигазой в одну и ту же пробирку звучит нелогично. Тем не менее, мы используем эндонуклеазы рестрикции типа 2S, и сайт узнавания фермента отделен от фактического места разреза. После того, как терминатор перевязывается в синюю плазмиду pGR, происходит постоянное лигирование.

Однако, имея рестрикционный фермент и лигазу в одной пробирке, проходящей через несколько циклов, мы можем достичь высокой эффективности закрытия. Начните эту процедуру с повторного суспендирования отдельных олигонуклеотидов в воде, не содержащей нуклеаз, в концентрации 100 микромоляров, затем приготовьте 10-кратный буфер для отжига. Затем пометьте микроцентрифужную пробирку с емкостью 1,5 миллилтера для каждого тестируемого терминатора.

В каждую пробирку добавьте 16 микролитров сверхчистой воды, 2 микролитра 10-кратного буфера для отжига и по 1 микролитру верхней и нижней нити олигонуклотидов из желаемых терминаторов. Очень важно убедиться, что заказанные вами олигонуклотиды имеют правильные липкие концы. Потому что после того, как они отожжены вместе, важно убедиться, что терминатор находится в правильной ориентации.

Если терминатор находится в неправильной ориентации, синий pGR не сможет проверить, функционирует ли терминатор. Далее поместите микроцентрифужные пробирки в поплавок и прокипятите их четыре минуты на водяной бане. Через четыре минуты выключите нагревательную пластину, но оставьте трубку в воде на ночь, чтобы она медленно остыла.

Храните отожженные терминаторы при температуре 20 градусов Цельсия. Чтобы сделать 40 наномолярное разведение отожженных терминаторов, сначала разморозьте их на льду, затем в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку добавьте 124 микролитра воды, не содержащей нуклеаз, на 1 микролитр отожженных терминаторов. Центрифугируйте образцы в течение 30 секунд при 10 000x g.

После отжима храните образцы на льду. В новый амплификатор подойдет пробирка, добавьте 6 микролитров воды, не содержащей нуклеаз. Затем добавьте один микролитр коммерческого буфера ДНК-лигазы.

Выполняйте все последующие шаги на льду. Затем добавьте 1 микролитр, содержащий от 35 до 50 нанограмм на микролитр синей плазмиды назначения pGR, 1 микролитр 40 наномолярных отожженных терминаторов, 0,5 микролитра коммерческой эндонуклеазы рестрикции BSA1 высокой точности и 0,5 микролитра коммерческой ДНК-лигазы. Центрифугируйте реакционную смесь при 10 000x g в течение 120 секунд.

Затем поместите трубку непосредственно в амплификатор и запустите следующую программу. 20 циклов по 1 минуте при 37 градусах Цельсия, затем 1 минута при 16 градусах Цельсия и затем один цикл по 15 минут при 37 градусах Цельсия. После прогона либо заморозьте и храните образцы при температуре 20 градусов Цельсия, либо сразу приступайте к преобразованию.

Преобразуйте реакции лигирования в химически компетентные клетки e. coli, используя любой подходящий протокол трансформации. Здесь ячейки JM109 преобразуются с помощью преобразования Zippy.

С помощью L-образной стеклянной хоккейной клюшки распределите 25 микролитров трансформированных клеток на предварительно нагретые пластины LB-агара, содержащие 1 миллимолярный ампициллин и 10 миллимолярную арабинозу. Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. Не высиживайте их более 24 часов.

Ампициллин быстро разлагается. На следующий день осмотрите цвет колоний. Успешное лигирование должно быть белым или желтым в видимом свете, а под синим или ультрафиолетовым светом он будет флуоресцировать зеленым

Неудачное лигирование приведет к образованию колонии, которая будет иметь синий цвет в видимом свете. Для каждого из терминаторов и контрольных приборов приготовьте пробирку, содержащую 5 миллилитров стерильного бульона LB с 1 миллимолярным ампициллином и 10 миллимолярной арабинозой. При выполнении этого протокола при использовании pGR очень важно убедиться в наличии надлежащих средств контроля.

Первым контролем должен быть как раз LB бульон. Следующим контролем должны быть клетки, которые имеют устойчивость к ампициллину, но не флуоресцируют под действием синего света. Они будут служить заготовкой.

Следующим элементом управления является плазмида pGR, которая не разрезается, поэтому у нее нет терминатора, и это будет служить базовым уровнем для прочности терминатора, и последняя из ваших пробирок будет предназначена для вашего образца. Под видимым светом с помощью стерильной петли выберите от 2 до 3 белых или желтых колоний и перенесите их в бульон LB. Дайте образцам инкубироваться в шейкере при температуре 37 градусов Цельсия при 160 об/мин в течение 16–18 часов.

На следующий день с помощью спектрофотометра определите оптическую плотность ячейки каждого образца на расстоянии 600 нанометров. Как правило, по прошествии этого промежутка времени ожидается внешний диаметр 600 от 0,8 до 1,0. Поместите стерильную пластину на 96 лунок в капюшон.

Для каждой пробы или контроля приготовьте 3 лунки со 199 микролитрами стерильного отвара ЛБ с ампициллином и арабинозой. Далее пипеткой 1 микролитр клеточного раствора из ночных отваров в отдельные лунки 96-луночной пластины. Наполните пластины дышащим чехлом, а затем встряхивайте их в течение 18-20 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 160 оборотах в минуту.

На следующий день с помощью считывателя пластин определите наружный диаметр 600, который должен составлять примерно 0,5. Кроме того, измерьте флуоресценцию G of P при длине волны возбуждения 395 нанометров и при излучении 509 нанометров. Измерение флуоресценции RFP на длине волны возбуждения 575 нанометров и излучении 605 нанометров.

Используя Excel, нормализуйте вариацию роста, разделив цветение на наружный диаметр 600. После нормализации определите относительную силу терминатора, взяв флуоресценцию терминатора GFP на контрольную флуоресценцию GFP и разделив ее на флуоресценцию терминатора RFP на управляющую флуоресценцию RFP. Были проанализированы фиксированные предполагаемые терминаторы от Т1 до 6, биоинформатически идентифицированные в микробактериальном фаге берналь 13, как описано в этом видео.

Эти результаты показывают относительную флуоресценцию. Все результаты нормализовались с использованием клеток, содержащих неразрезанные, немодифицированные ГРР в качестве контроля. Т3 оказался сильным терминатором.

Все результаты представляют собой отдельные колонии, выращенные в трех экземплярах и усредненные для визуального представления. Полосы погрешностей представляют собой отклонения между усредненными точками данных. Чтобы определить наилучший эталонный контроль для количественной оценки прочности терминатора, сравнивали исходные данные с использованием исходной плазмиды pGR, не содержащей терминатора, и синей pGR, клонированной с последовательностью, о которой известно, что она не является терминатором.

Как видно на рисунке, оба контроля показали схожие уровни экспрессии GFP и RFP и, что более важно, показали схожие отношения GFP к RFP. Все эти результаты представляют собой отдельные колонии, которые были выращены в трех экземплярах и усреднены для визуального представления. После освоения этой техники может потребоваться всего 72 часа, включая время доставки и заказа.

Важно отметить, что pGR blue работает только в e.coli. Кроме того, поскольку мы рассматриваем только небольшую часть терминатора, мы действительно не имеем представления о других регуляторных элементах, которые могут контролировать транскрипцию. Чтобы проверить результаты, полученные с помощью этого протокола, с помощью pGR blue можно использовать дополнительные методы, такие как количественная ПЦР.

Кроме того, вставка pGR может быть вырезана и перевязана в плазмиду по вашему выбору.