Мышь Модель Ретинального ишемией реперфузии через Elevation внутриглазного давления

Общая цель этой методики состоит в том, чтобы предоставить экспериментальную модель ишемии-реперфузионного повреждения сетчатки и его патологических последствий. Этот метод обычно используется для исследования механизмов, лежащих в основе ишемии-реперфузии сетчатки, а также для оценки потенциальных терапевтических подходов к лечению сопутствующих патологий. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она создает травму, направленную на глазные структуры, при этом нанося минимальный ущерб окружающим тканям.

Полезность этой методики простирается до понимания и трехмесячного множественных проявлений ишемии-реперфузионного повреждения сетчатки, включая: воспаление, окислительный стресс и дисфункцию взгляда в нейроваскулярном блоке сетчатки. Видеодемонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что хирургические методы установки канюли может быть трудно воспроизвести без визуального руководства. Перед началом процедуры согрейте пустую клетку на столе.

Затем вставьте острый конец предварительно проколотой трубки первичного набора в бутылку с 0,1% гепарином натрия и подвесьте дно гепарина натрия на удлинитель для внутривенного введения. Защелкните крышку воздушного фильтра на трубке. Затем поднимите флакон с гепарином натрия на 163 сантиметра от столешницы до пика капельницы гепарина натрия, чтобы создать давление потока гепарина натрия в 120 миллилитров ртутного столба.

Откройте первичную трубку с предварительно пробитой Y-образной зоной, чтобы позволить гепарину натрия заполнить трубку, и подсоедините первичную трубку предварительно пробитой Y-образной точки к пятиклапанному коллектору. Затем с помощью фитингов с наружной резьбой Люэра и трубками с наружной резьбой Люэра подсоедините полудюймовые иглы 30 калибра к коллектору с пятью портами. Вставьте каждую из игл в отдельный десятидюймовый сегмент трубки 30 калибра.

Затем с помощью гемостатиков ломают новые полудюймовые кончики игл 30 калибра и вставляют их тупые концы в открытые концы трубки 30 калибра. Затем с помощью ленты расположите игольчатые трубки таким образом, чтобы трубки, подключенные к внутренним портам, располагались поверх трубок, подключенных к внешним портам, чтобы предотвратить запутывание трубки во время канюляции передней камеры. Теперь включите поток 0,1% гепарина натрия в пятиклапанный коллектор и в каждый отдельный порт на две-три минуты, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Затем закройте все порты на коллекторе с пятью клапанами. Для проведения канюляции, после введения анестезии, поместите всех мышей в теплую клетку на операционном столе, подтвердив достижение глубокой анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги через пять-десять минут. Затем введите по одной капле тропикамида для расширения зрачков и по одной капле пропаракаина для местной анестезии в глаза каждого из животных и расположите мышей в порядке обезболивания, так что первая мышь, которой будет нанесена анестезия, будет первой мышью, которой будет сделан канюлирование.

Ожидая, пока глазные капли подействуют, подготовьте четырехдюймовые прямые куски ленты, плотно натянув ленту перед разрывом и отложив по одному куску ленты на каждое животное. Обратите внимание, что если не натянуть ленту плотно, это приведет к скручиванию ленты. Когда первая мышь будет готова, поместите животное под хирургический микроскоп.

Затем включите первый 0,1%-ный гепариновый натриевый порт на пятиклапанном коллекторе и с помощью пары щипцов аккуратно поддержите один глаз. Затем введите иглу канюли 30 калибра в переднюю камеру примерно на полпути между зонулярными волокнами и верхушкой роговицы. Следите за тем, чтобы не проникнуть в конреа во второй раз.

Обратите внимание, что для введения канюли глубоко в переднюю камеру используются мягкие скручивающие движения. Теперь прижмите трубку 30 калибра к столешнице, чтобы свести к минимуму любое движение вставленной канюли при дотягивании до куска ленты, и используйте ленту, чтобы прикрепить трубку к столу. После того, как трубка будет закреплена, запишите время начала операции.

Используйте микроскоп, чтобы убедиться в отсутствии утечки и в том, что ишемический реперфузионный глаз больше, чем контралатеральный глаз, чтобы установить наличие растяжения глаза. Наносите гипромеллозу на оба глаза каждые 30 минут, до конца эксперимента, чтобы смазать роговицу и закрыть любые микроутечки. Если животное шевельнулось во время процедуры, приподнимите хвост и введите кетаминовый усилитель внутрибрюшинно.

Через 90 минут после канюляции первого животного аккуратно вытяните канюлю из передней камеры, и смажьте оба глаза смазывающим желе. По мере удаления последующих канюль поместите каждую мышь обратно в клетку на операционном столе до тех пор, пока животные полностью не выздоровеют. После того как все канюли будут удалены, продезинфицируйте их спиртовыми салфетками.

Затем с помощью шприца объемом 60 миллилитров, наполненного воздухом, вытесните гепарин натрия из пятиклапанного коллектора, игл 30 калибра, трубки 30 калибра и канюль. Затем промойте все инструменты шприцем объемом 60 миллилитров, наполненным дистиллированной водой. Наконец, удалите дистиллированную воду из всех материалов с помощью 60 миллилитров воздуха и храните продезинфицированное и промытое оборудование для последующего использования.

Иммуномаркировка ядер нейронов NeuN выявляет значительную потерю нурональных клеток после ишемия-реперфузионного повреждения с помощью конфокальной микроскопической визуализации через семь дней после ишемии-реперфузионного повреждения. Действительно, ручная количественная оценка NeuN-положительных клеток в контрольной группе и глазах с ишемией-реперфузией демонстрирует снижение количества нейронов слоя клеток гангелиона после травмы, что указывает на наличие гибели, вызванной ишемией-реперфузией. Более низкие амплитуды a-волны и b-волны, задокументированные электроретинографией, также указывают на возникновение индуцированных ишемией-реперфузией нарушений функции нейронов сетчатки по сравнению с контрольными неповрежденными глазами.

После освоения эта техника может быть выполнена на десяти животных примерно за пять часов, включая последние два часа, проведенные в ожидании, пока мыши оправятся от анестезии. При попытке проведения этой процедуры важно соблюдать глубокую анестезию. В качестве эффективной седативной меры предотвратит смещение канюли при движении животного.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как электроретинография, чтобы ответить на дополнительные вопросы о функции сетчатки. Этот метод позволил исследователям в области офтальмологии, нейробиологии и сосудистой биологии изучить нейроваскулярный патогенез сетчатки и терапевтическое вмешательство у грызунов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создать целевую травму сетчатки при помощи канюляции передней камеры глаза.

Не забывайте, что работа с хирургическими инструментами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование эффективного обезвреживания острых предметов.