Одновременная ДНК-РНК Извлечение из прибрежных отложений и Количественная 16S-рРНК и транскриптов с помощью ПЦР в реальном времени

Общая цель этой процедуры заключается в извлечении высокопродуктивных и качественных ДНК и РНК из прибрежных морских отложений и последующем количественном определении генов и транскриптов 16S рибосомальной РНК. Этот метод, описывающий экстракцию ДНК и РНК из морских отложений с последующей количественной ПЦР, является ключевым этапом молекулярного анализа численности и разнообразия микроорганизмов в окружающей среде. Основное преимущество этого метода заключается в том, что его можно использовать для совместной экстракции ДНК и РНК из одного и того же образца, который затем может быть использован для последующего анализа, такого как количественная ПЦР.

Демонстрировать процедуру будут доктор Энрико Татти из NUI Голуэй и Дункан Суини, аспирант из Университета Эссекса. Для совместного извлечения ДНК и РНК из прибрежных отложений после подготовки материалов, свободных от РНК, и сбора образцов прибрежных отложений в соответствии с текстовым протоколом, перенесите 0,5 грамма осадка в двухмиллилитровую пробирку для лизинга шариков. Добавьте в пробирку 500 микролитров фосфатного буфера CTAB и 500 микролитров фенола:хлороформа:изоамилового спирта и переверните от пяти до 10 раз, чтобы гомогенизировать образец.

Вихрь на полной скорости в течение 2,5 минут перед вращением при 16 000 g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем в вытяжном шкафу извлеките верхний водный слой и перенесите его в новую стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем поместите образцы на лед и добавьте 500 микролитров ледяного хлороформа:изоамилового спирта.

Затем переверните трубку несколько раз, пока не станет видна эмульсия, и центрифугируйте как раньше. В вытяжной шкаф извлеките верхний водный слой и поместите в новую стерильную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем, чтобы высадить нуклеиновые кислоты, добавьте два объема 30% раствора ПЭГ натрия хлорида и хорошо перемешайте.

Инкубируйте на льду в течение двух часов или оставьте образцы при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. После инкубации образцы центрифугируют при температуре 16 000 раз больше g при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. С помощью микропипетки аккуратно удалите надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы не потревожить гранулу.

Оставьте в пробирке примерно 10 микролитров раствора ПЭГ и добавьте один миллилитр ледяного 70% этанола. После вращения образца с помощью микропипетки медленно удалите этанол, стараясь не прикасаться к грануле. Затем центрифугируйте в течение пяти секунд и удалите остатки этанола.

Дайте грануле высохнуть на воздухе в течение пяти минут, прежде чем использовать 50 микролитров воды, обработанной DEPC, для ресуспензии. Аликвота: образец 15 микролитров для ДНК и 30 микролитров для РНК. Наиболее важным шагом является обеспечение того, чтобы гранула ДНК/РНК не вытеснялась при удалении надосадочной жидкости и не оставалось остаточного этанола до ресуспендирования гранулы в воде, поскольку он ингибирует последующую молекулярную реакцию.

Чтобы переварить ДНК в образце РНК, добавьте три микролитра буфера ДНКазы I и 1,5 микролитра ДНКазы I к 30 микролитрам аликвоты нуклеиновой кислоты. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Смешайте реагент для инактивации ДНКазы путем вортексирования в течение 30 секунд.

Затем добавьте в образец 4,8 микролитра раствора и выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут, периодически постукивая по дну пробирок для перемешивания раствора. После вращения образца перенесите надосадочную жидкость, содержащую РНК, в новую пробирку, стараясь не перенести осадок. Чтобы проверить качество РНК, разбавьте два микролитра РНК, один из 10, добавив 18 микролитров стерильной деионизированной воды, не содержащей РНКазы.

В отдельных реакциях ПЦР в стерильную 0,5-литровую ПЦР-пробирку добавляйте один микролитр чистой или один к 10 разведению РНК. Следуя таблице в текстовом протоколе, добавьте компоненты ПЦР-реакции для амплификации гена 16S рибосомальной РНК. Включите положительный контроль, контроль ингибитора ПЦР и отрицательный контроль.

Затем запустите ПЦР-реакции с использованием следующих параметров амплификации. Чтобы получить кДНК первой нити из РНК, добавьте реакционные реагенты в ПЦР-пробирку объемом 0,2 миллилитра в соответствии с текстовым протоколом. Инкубируйте образцы при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Затем поместите образцы на лед не менее чем на одну минуту перед инкубацией при температуре 25 градусов Цельсия в течение 10 минут. После инкубации добавьте реагенты из приведенной здесь таблицы из текстового протокола и инкубируйте при температуре 55 градусов Цельсия в течение 50 минут. Затем инактивируйте реакцию при температуре 72 градуса Цельсия на 10 минут.

После генерации стандартов ДНК и РНК для количественной ПЦР в соответствии с текстовым протоколом разморозьте образцы ДНК и кДНК окружающей среды, стандарты и реагенты для количественной ПЦР на льду. Разбавьте стандарты нуклеиновых кислот и получите один из 10 разбавлений окружающей среды ДНК и кДНК от чистого до 10 до минус трех. Сделайте мастер-микс на общее количество реакций плюс 10% и хорошо перемешайте.

Добавьте 19 микролитров мастер-смеси и один микролитр шаблона в трех экземплярах в каждую лунку в 96-луночный оптический планшет для количественной ПЦР. Используйте оптическую крышку для количественной ПЦР, чтобы накрыть планшет. Затем кратковременно центрифугируйте планшет и загрузите его в нагревательный блок машины для количественной ПЦР.

Затем откройте программное обеспечение для управления количественной ПЦР, перейдите на вкладку «Протокол», нажмите «Создать новый» и добавьте следующие условия амплификации. Установите объем выборки равным 20 микролитрам, нажмите OK и сохраните протокол. Теперь выберите вкладку «Пластина».

Затем в разделе «Редактировать выбранное» нажмите «Выбрать флуорофор». Добавьте репортерный краситель для соответствующего зонда и нажмите OK. Выделите лунки, содержащие стандарты, затем в меню Тип образца выберите Стандарт. Выберите Replicate Series, чтобы изменить Replicate Size на три, и нажмите Apply.

Выберите Серия разбавления, чтобы добавить расчетную начальную концентрацию для стандартной. Укажите коэффициент разбавления 10, выберите Убывающий или Увеличивающийся в зависимости от порядка, в котором стандартная кривая была добавлена на пластину, и нажмите Применить. Выделите позиции скважин, содержащие неизвестные пробы, и выберите Неизвестно в раскрывающемся меню Тип выборки.

Выберите «Тиражировать ряд» и измените параметр «Размер репликации» на три, затем нажмите «Применить». В разделе Имя образца измените имена образцов и повторите процедуру для контрольных колодцев без шаблона. Затем в окне редактора пластин нажмите OK и сохраните файл.

Затем нажмите «Начать выполнение». Когда прогон будет завершен, выберите вкладку Количественная оценка (Quantification) для отображения стандартной кривой, стандартных дескрипторов кривых и графиков усиления. Наконец, выберите вкладку «Данные количественной оценки» для значений Cp и соответствующей начальной величины для генов неизвестных образцов.

Определите количество копий генов на грамм сырого веса осадка в соответствии с текстовым протоколом. Как показано на этом изображении геля, успешная экстракция нуклеиновых кислот дает прозрачные полосы ДНК и РНК, в которых видны острые полосы рибосомной РНК 23S и 16S, в дополнение к наличию высокомолекулярной полосы геномной ДНК. На рисунке показано, что при правильном приготовлении и амплификации десятикратного диапазона разведения для получения стандартной кривой, которая будет использоваться для реакции количественной ПЦР, наблюдается разница в 3,3 цикла между каждым стандартным разведением.

Важно сообщать о точках пересечения или значениях Cp из элемента управления без шаблона или NTC, если он присутствует. Если это происходит, то для стандартных и неизвестных выборок за 3,3 цикла накладывается пороговое значение Cp или логарифмическое кратное значение, превышающее значение Cp NTC, как описано ранее. Здесь проводилось амплификация проб окружающей среды от чистых, 10 до минус одного, 10 до минус двух и 10 до минус трех разведений.

Аккуратный образец не амплифицировал, и значения Cp от 10 до минус 10 до минус трех разведений составили 24,12, 26,02 и 28,40 соответственно. Как видно на этом графике, желательны стандартные дескрипторы кривых, включая значения R в квадрате 0,99 и эффективность ПЦР в диапазоне от 90 до 110%. В этом эксперименте NTC Cp составлял 30,5, а отрицательный предел Cp был наложен на 27,2.

Преобразование обилия генов в расчет на грамм сырого веса осадка привело к разведению в 2,5 раза по 10 с точностью до седьмого и в 7,1 к 10 к седьмому и от 10 до минус двух разведений соответственно. Cp разбавления от 10 до минус трех было больше, чем пороговое значение NTC. В этом случае в качестве оптимального матричного разведения было выбрано соотношение от 10 до отрицательной двойки.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что РНК может быстро разрушаться, поэтому важно держать образец на льду и использовать перчатки, чтобы избежать постоянного загрязнения РНКазой. Не забывайте, что мы работаем с фенол-хлороформом и изамиловым спиртом, а это может быть крайне опасно. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата, перчаток и защитных очков, а также работа под химическим капюшоном.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как извлекать ДНК и РНК и количественно определять распространенность генов и транскриптов в морских прибрежных отложениях. Помните, что эта процедура может быть легко использована для извлечения ДНК и РНК и количественного определения ряда генов-мишеней из большинства образцов окружающей среды, включая почву.