Быстрое сканирование электронного парамагнитного резонанса открывает новые возможности для обработки изображений Физиологически Важные параметры В Vivo
26 сентября 2016 г.
Метод новый метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), быстрое сканирование ЭПР (RS-ЭПР), демонстрируется для 2D спектральной пространственной визуализации , которая превосходит традиционные непрерывного излучения (CW) техники и открывает новые места для визуализации в естественных условиях. Результаты продемонстрированы на частоте 250 МГц, однако данный метод применим при любой частоте.
Общая цель экспресс-сканирования и электронной парамагнитной визуализации, или RSEPRI, заключается в предоставлении количественной информации о концентрации кислорода, pH, окислительно-восстановительном статусе и концентрации сигнальных молекул, которые полезны для биомедицинских исследований. EPRI — это инструмент, который может быть использован для ответа на ключевые вопросы в исследованиях рака, касающиеся опухолевой среды. Основное преимущество ЭПР с помощью быстрого сканирования заключается в том, что вы можете получить больше информации за гораздо более быстрое время, используя более широкий спектр молекул зонда по сравнению с непрерывной волновой или непрерывной ЭПР.
Молекулы, чувствительные к окислительно-восстановительному потенциалу или pH, являются хорошим примером того, где EPRI с быстрым сканированием действительно блистает. Начните эту процедуру с вычисления экспериментальных условий быстрого сканирования, определенных в текстовом протоколе. Одним из важных аспектов быстрого сканирования является понимание зависимости сигнала от ширины полосы резонатора и экспериментальных условий, таких как ширина развертки по частоте сканирования.
Чтобы действительно оптимизировать эксперимент, вам нужно понимать все три аспекта. Драйвер катушки с быстрым сканированием имеет два усилителя. При выборе конденсатора коробка конденсаторов должна быть сбалансирована с одинаковой емкостью с каждой стороны коробки.
Обе стороны идут последовательно. Открутите верхнюю крышку коробки конденсатора и вставьте с обеих сторон конденсаторы, равные определенному значению. Установите на место верхнюю часть коробки конденсатора и закрутите ее, чтобы убедиться, что она остается на месте.
С помощью передней панели драйвера резонирующей катушки отрегулируйте выходную частоту до тех пор, пока синусоидальная форма сигнала не достигнет максимальной амплитуды. Чтобы приготовить радикалы, достаньте N-15 PDT из морозилки и дайте контейнеру нагреться до комнатной температуры. Взвесьте 1,4 миллиграмма N-15 PDT с помощью аналитических весов.
Добавьте 1,4 миллиграмма N-15 PDT в 15 миллилитров деионизированной воды для получения конечной концентрации 0,5 миллимоляра. Далее соедините 50 миллиграммов BMPO с пятью миллилитрами воды в 16-миллиметровой кварцевой облучательной трубке. Добавьте 100 микролитров 300 миллимолярной перекиси водорода.
Облучайте смесь в 16-миллиметровой кварцевой облучательной трубке ультрафиолетовой лампой среднего давления мощностью 450 Вт в течение пяти минут. С помощью стеклянной переносной пипетки перенесите две целых пять миллилитров облученного раствора BMPO-OH из кварцевой облучательной трубки на одну сторону кварцевой пробирки с трехмиллиметровым делителем. Перенесите оставшиеся две целых пять десятых миллилитров облученного BMPO-OH в другую сторону кварцевой пробирки для образца с помощью делителя.
Вторым важным шагом является понимание кривой насыщения мощности. По мере увеличения скорости сканирования вы получаете доступ к более высоким мощностям и амплитудам сигнала, прежде чем сигнал будет насыщен. Большая амплитуда сигнала — еще один способ сократить время сбора данных.
Сначала настройте резонатор с водным образцом радикала нитрооксида, вставив 15-миллилитровый образец 0,5 миллимоляра N-15 PDT в воду в 16-миллиметровую кварцевую электронно-резонансную трубку. Вставьте кварцевую трубку в сторону обнаружения резонатора с быстрым электронным парамагнитным резонансом или резонатором RSEPR. Изменяйте частоту источника прибора до тех пор, пока она не совпадет с частотой стороны обнаружения, содержащей образец.
Теперь измените частоту стороны возбуждения, чтобы она соответствовала частотам источника эксперимента и стороны обнаружения резонатора. Изменяйте частоту стороны возбуждения, поворачивая переменный конденсатор в полости резонатора. Для настройки приборной консоли и основного магнита включите спектрометр и выберите эксперимент, который будет записывать данные о переходных процессах со временем на абсциссе.
Выполните построение кривой насыщения мощности на стандартном образце радикалов нитрооксида в тех же экспериментальных условиях, которые будут использоваться для изучения радикалов, чувствительных к pH или окислительно-восстановительному статусу. После того, как система настроена, градиенты наносятся вручную или с помощью компьютерной программы для эксперимента с визуализацией. Интенсивность сигнала ЭПР прямо пропорциональна микроволновому полю в резонаторе, которое заставляет спин переходить с одного энергетического уровня на другой.
Это микроволновое поле называется B1. B1 пропорционально квадратному корню из микроволновой мощности. Поскольку мощность микроволновой печи увеличивается в четыре раза, B1 удваивается. На этом рисунке мощность увеличена в четыре раза с восьми до 32 милливатт, а B1 — в два раза с 18 до 36 миллигаусс.
Кривая насыщения мощности может быть построена путем построения графика относительной амплитуды как функции квадратного корня из микроволновой мощности, или, если эффективность резонатора известна, B1. Линейная область этой кривой показывает область мощности, в которой сигнал ЭПР не насыщен и не искажается. Одним из преимуществ эксперимента с быстрым сканированием является то, что линейный диапазон мощности расширен, представленный цветными точками, по сравнению с обычным экспериментом непрерывного сканирования, представленным черными точками. Здесь показано двумерное спектральное пространственное изображение фантомов, состоящее из аддукта BMPO-OH, разделенного на три миллиметра при концентрации пяти микромоляров.
На срезе изображения видна спектральная форма на частоте 250 мегагерц. На этом изображении показан азотильный радикал N-14, который может быть использован для захвата оксида азота in vivo в фантоме, где стенка толщиной одна целых пять миллиметров разделяет две камеры для образцов. Здесь показана спектральная форма на частоте 250 мегагерц.
Двумерное изображение pH-чувствительных триарилметиловых радикалов отражает разницу в спектральных характеристиках, когда pH фосфатного буфера равен семи целым целым без единой половины или pH равен семи целым четырем. На этом изображении показан динитриоксид N-15 в двухкамерном фантоме с 10-миллиметровой проставкой. Первоначально оба отсека содержат 0,5 миллимолярного зонда.
Добавление глутатиона к динитриоксиду разрушает восстановленную область линкера и приводит к образованию двух мононитроксидов, изменение, которое отражается на двумерном изображении. Разработка ЭПР с быстрым сканированием — это полная смена парадигмы в наших возможностях изучения молекул с неспаренными электронами. Сегодня вы видели его применение для ЭПР in vivo, но он также обладает замечательными возможностями для низкотемпературных исследований соединений с металлами в них и многих других видов систем.
Для всех образцов, которые мы изучали до сих пор, мы получили улучшения в соотношении сигнал/шум как минимум на порядок, а иногда и больше.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен новый метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), известный как ЭПР с быстрым сканированием (RS-EPR), предназначенный для двухмерной спектральной пространственной визуализации. RS-EPR обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами непрерывного волнистого излучения (CW), особенно в контексте применения для визуализации in vivo.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биомедицинская визуализация
- Электронный парамагнитный резонанс
- Исследования рака
Теоретическое обоснование
- Метод быстрого сканирующего электронного парамагнитного имиджинга (RSEPRI) позволяет получать количественные данные о различных биологических параметрах.
- Он особенно полезен для оценки микроокружения опухолей в исследованиях рака.
- Данный метод обеспечивает более высокую скорость сбора данных по сравнению с традиционными методами.
- Он позволяет использовать более широкий спектр молекул-зондов, чувствительных к окислительно-восстановительному статусу и pH.
Цель исследования
- Для совершенствования методов визуализации в биомедицинских исследованиях.
- Для получения подробной информации о концентрации кислорода, pH и сигнальных молекулах.
- Для углубления понимания микроокружения опухоли.
Используемые методы
- Расчет условий эксперимента для быстрого сканирования.
- Оценка зависимости сигнала от полосы пропускания резонатора.
- Оценка условий эксперимента, таких как ширина диапазона частотного сканирования.
- Применение RS-EPR на частоте 250 MHz с возможностью использования других частот.
Основные результаты
- Демонстрация превосходства RS-EPR над CW-EPR в визуализации.
- Возможность получения большего объема информации за более короткий промежуток времени.
- Успешная визуализация молекул, чувствительных к окислительно-восстановительному статусу и pH.
- Потенциал для более широкого применения в визуализации in vivo.
Выводы
- RS-EPR представляет собой значительный прогресс в методах ЭПР-визуализации.
- Этот метод открывает новые возможности для исследований в области онкологии и других биомедицинских направлений.
- Будущие исследования могут расширить область его применения на различных частотах.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
ЭПР-визуализация с быстрым сканированием позволяет проводить количественную оценку в режиме реального времени таких физиологически значимых параметров, как парциальное давление кислорода, pH, окислительно-восстановительный статус и активные сигнальные молекулы в живых системах. Эта возможность способствует снижению механистических рисков в исследованиях онкологических и воспалительных заболеваний, обеспечивая прямое считывание условий микроокружения, которые влияют на терапевтический ответ и развитие резистентности. Повышенная чувствительность, пространственное разрешение и скорость сбора данных данного метода увеличивают прогностическую достоверность в доклинических моделях, что способствует более раннему принятию решений о целесообразности дальнейшего развития (go/no-go) в процессах валидации мишеней и оптимизации соединений-лидеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования динамики оксигенации, pH и окислительно-восстановительных процессов в моделях, релевантных заболеванию.
- Операционная ценность: обеспечивает количественные, пространственно-разрешенные показатели биомаркеров микроокружения для уточнения активности путей и степени взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет корреляции изменений сигнала зонда с функциональными фенотипами, что повышает достоверность взаимосвязей между мишенью и заболеванием.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные, воспроизводимые спектрально-пространственные изображения молекул-репортеров радикалов, чувствительных к физиологическим стимулам.
- Количественные данные: обеспечивает концентрационно-зависимые изменения сигнала для кислорода, pH и редокс-форм, что позволяет проводить анализ дозозависимого отклика и профилирование ингибиторов.
- Повторное использование платформы: совместима с различными молекулами-зондами (например, BMPO-OH для •OH, нитранил для NO•, триарилметил для pH) в различных экспериментальных установках.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: позволяет напрямую визуализировать гипоксию, ацидоз и окислительный стресс в опухоли — ключевые признаки прогрессирования рака и резистентности к терапии.
- Трансляционная преемственность: связывает механистические данные, полученные на этапе фундаментальных исследований, с доклинической валидацией путем мониторинга одних и тех же биомаркеров в различных моделях.
- Оптимизация разработки с учетом рисков: обеспечивает возможность лонгитюдного отслеживания изменений микроокружения для корректировки графиков дозирования и стратегий комбинированной терапии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
ЭПР со сканированием в быстром режиме (Rapid-scan EPR) вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез относительно мишени и идентификации ведущих соединений до оценки доклинической эффективности, особенно в тех случаях, когда модуляция микроокружения является механизмом действия или фактором резистентности.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем визуализации того, как генетические или фармакологические воздействия изменяют уровни кислорода, pH или окислительно-восстановительные параметры в клеточных и тканевых моделях.
- Скрининг: позволяет разрабатывать методы анализа соединений, модулирующих гипоксический сигналинг, антиоксидантные пути или pH-регулирующие ферменты, с помощью измеряемых сдвигов ЭПР.
- Аналитика: обеспечивает количественные рациометрические измерения интенсивности сигнала зонда и формы спектра, что позволяет проводить сравнение между различными условиями и временными точками.
- Трансляционные исследования: связывают результаты in vitro с данными in vivo путем визуализации тех же радикальных репортеров в фантомах и живых системах.
- Корпоративное использование: функционирует как неразрушающий, готовый к работе модуль визуализации, совместимый с существующими комплексами для доклинической визуализации и адаптируемый к различным химическим составам зондов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет снижения неопределенности вкладов микроокружения в фенотип.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и пропускную способность благодаря более быстрому сбору данных и более высокому соотношению сигнал/шум по сравнению с CW-EPR.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует сортировку портфеля за счет раннего выявления соединений, которые оказываются неэффективными из-за неблагоприятных взаимодействий с микроокружением на начальных этапах разработки.
- Влияние на портфель: Обеспечивает распределение ресурсов с учетом рисков путем приоритизации агентов с благоприятным воздействием на оксигенацию опухоли, нормализацию pH или окислительно-восстановительный баланс.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы в области ЭПР-спектроскопии, химии радикалов и обращения с биологическими образцами.
- Необходим доступ к ЭПР-спектрометру с функцией быстрого сканирования, оснащенному кросс-петлевым резонатором и возможностью создания градиента для 2D-визуализации.
- Требуется стандартизация подготовки зондов, калибровки и контроля условий окружающей среды (температура, влажность) на всех участках исследования.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных радикальных репортеров (например, pH-чувствительных в сравнении с редокс-чувствительными) и типов тканей (фантомы, ex vivo, in vivo).
- Практические ограничения включают стабильность зонда, биодоступность и возможные фоновые сигналы от эндогенных радикалов в сложных биологических матрицах.
