Быстрое сканирование электронного парамагнитного резонанса открывает новые возможности для обработки изображений Физиологически Важные параметры
26 сентября 2016 г.
Метод новый метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), быстрое сканирование ЭПР (RS-ЭПР), демонстрируется для 2D спектральной пространственной визуализации , которая превосходит традиционные непрерывного излучения (CW) техники и открывает новые места для визуализации в естественных условиях. Результаты продемонстрированы на частоте 250 МГц, однако данный метод применим при любой частоте.
Общая цель быстрого сканирующего электронного парамагнитного резонансного томографического метода (RSEPRI) заключается в получении количественных данных о концентрации кислорода, pH, окислительно-восстановительном статусе и концентрации сигнальных молекул, которые имеют важное значение для биомедицинских исследований. Метод EPRI является инструментом, позволяющим ответить на ключевые вопросы в области исследований рака, касающиеся опухолевого микроокружения. Основным преимуществом быстрого сканирующего ЭПР-томографического метода является возможность сбора большего объема информации за значительно меньшее время с использованием более широкого спектра зондных молекул по сравнению с ЭПР-томографией в режиме непрерывного волны (CW EPR).
Молекулы, чувствительные к окислительно-восстановительному статусу или pH, являются отличным примером того, где метод быстрого сканирования EPRI проявляет себя наилучшим образом. Начните выполнение данной процедуры с расчета условий эксперимента для быстрого сканирования, определенных в текстовом протоколе. Важным аспектом быстрого сканирования является понимание зависимости сигнала от полосы пропускания резонатора и таких экспериментальных условий, как ширина диапазона развертки частоты сканирования.
Для полноценной оптимизации эксперимента необходимо понимать работу всех трех компонентов. Драйвер катушки быстрого сканирования оснащен двумя усилителями. При выборе конденсатора необходимо обеспечить балансировку блока конденсаторов, чтобы с каждой стороны блока была одинаковая емкость.
Две стороны соединены последовательно. Открутите верхнюю крышку коробки конденсатора и установите с обеих сторон конденсаторы, значения которых равны определенному значению. Установите верхнюю крышку коробки конденсатора и прикрутите ее, чтобы обеспечить надежную фиксацию.
С помощью передней панели драйвера резонансной катушки настройте выходную частоту до достижения максимальной амплитуды синусоидального сигнала. Для подготовки радикалов извлеките N-15 PDT из морозильной камеры и дайте контейнеру прогреться до комнатной температуры. Отвесьте 1,4 milligrams N-15 PDT с помощью аналитических весов.
Добавьте 1,4 mg N-15 PDT в 15 ml деионизированной воды для получения конечной концентрации 0,5 mM. Затем объедините 50 mg BMPO с 5 ml воды в кварцевой трубке для облучения диаметром 16 mm. Добавьте 100 µL 300 mM перекиси водорода.
Облучайте смесь в кварцевой трубке для облучения диаметром 16 мм с помощью ультрафиолетовой лампы среднего давления мощностью 450 Вт в течение пяти минут. С помощью стеклянной переносной пипетки перенесите 2,5 мл облученного раствора BMPO-OH из кварцевой трубки для облучения в одну из половин кварцевой кюветы диаметром 16 мм с разделителем шириной 3 мм. Перенесите оставшиеся 2,5 мл облученного BMPO-OH в другую часть кварцевой кюветы с разделителем.
Вторым критическим шагом является понимание кривой насыщения мощности. При увеличении скорости сканирования вы получаете доступ к более высоким мощностям и бóльшим амплитудам сигнала до того, как наступит насыщение сигнала. Увеличение амплитуды сигнала — это еще один способ сократить время сбора данных.
Сначала настройте резонатор с помощью водного образца нитроксидного радикала: поместите 15 мл 0,5 мМ раствора N-15 PDT в воде в кварцевую трубку для электронного парамагнитного резонанса диаметром 16 мм. Вставьте кварцевую трубку в детектирующую часть кросс-луп резонатора для быстрого сканирования электронного парамагнитного резонанса (RSEPR). Изменяйте частоту источника прибора до тех пор, пока она не совпадет с частотой детектирующей части, в которой находится образец.
Теперь измените частоту возбуждающей стороны так, чтобы она соответствовала частотам источника эксперимента и детектирующей стороны резонатора. Измените частоту возбуждающей стороны, поворачивая переменный конденсатор внутри полости резонатора. Для настройки консоли прибора и основного магнита включите спектрометр и выберите эксперимент, который регистрирует переходные данные с временем по оси абсцисс.
Постройте кривую насыщения мощностью для стандартного образца нитроксильного радикала при тех же экспериментальных условиях, которые будут использоваться для изучения радикалов, чувствительных к pH или окислительно-восстановительному статусу. После настройки системы градиенты применяются вручную или с помощью компьютерной программы для проведения эксперимента по визуализации. Интенсивность ЭПР-сигнала прямо пропорциональна микроволновому полю в резонаторе, которое вызывает переход спина с одного энергетического уровня на следующий.
Это микроволновое поле обозначается как B1. B1 пропорционально квадратному корню из мощности микроволнового излучения. При увеличении мощности в четыре раза значение B1 удваивается. На данном рисунке мощность увеличена в четыре раза — с 8 до 32 мВт, и B1 увеличилось вдвое — с 18 до 36 мГс.
Кривую насыщения мощностью можно построить, отобразив относительную амплитуду как функцию квадратного корня из мощности микроволн или, если эффективность резонатора известна, B1. Линейный участок этой кривой указывает на диапазон мощностей, при которых сигнал ЭПР не насыщен и не искажен. Одним из преимуществ эксперимента с быстрым сканированием является расширение линейного диапазона мощностей, обозначенного цветными точками, по сравнению с обычным экспериментом в режиме непрерывного излучения (CW), обозначенным черными точками. Здесь представлено двумерное спектрально-пространственное изображение фантомов, состоящих из аддукта BMPO-OH, расположенных на расстоянии трех миллиметров друг от друга при концентрации пять микромоляр.
Срез изображения демонстрирует спектральный профиль при 250 МГц. На этом изображении представлен нитранил-радикал N-14, который может быть использован для захвата оксида азота in vivo в фантоме, где стенка толщиной 1,5 мм разделяет две камеры с образцами. Здесь показан спектральный профиль при 250 МГц.
Двумерное изображение pH-чувствительных триарилметильных радикалов отражает различие в спектральных характеристиках при значении pH фосфатного буфера 7,0 или pH 7,4. На данном изображении представлен N-15 динитроксид в двухкамерном фантоме с разделителем 10 мм. Первоначально обе камеры содержат зонд в концентрации 0,5 мМ.
Добавление глутатиона к динитроксиду разрушает восстановленный участок линкера и приводит к образованию двух мононитроксидов; это изменение отражается на двухмерном изображении. Разработка ЭПР со сканированием в быстром режиме представляет собой полную смену парадигмы в наших возможностях изучения молекул с неспаренными электронами. Сегодня вы увидели применение этого метода в ЭПР in vivo, однако он также открывает прекрасные возможности для низкотемпературных исследований соединений, содержащих металлы, и многих других типов систем.
Для всех образцов, изученных нами к настоящему моменту, было достигнуто улучшение соотношения сигнал/шум как минимум на порядок, а в некоторых случаях и более того.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен новый метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), известный как ЭПР с быстрым сканированием (RS-EPR), предназначенный для двухмерной спектральной пространственной визуализации. RS-EPR обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами непрерывного волнистого излучения (CW), особенно в контексте применения для визуализации in vivo.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биомедицинская визуализация
- Электронный парамагнитный резонанс
- Исследования рака
Теоретическое обоснование
- Метод быстрого сканирующего электронного парамагнитного имиджинга (RSEPRI) позволяет получать количественные данные о различных биологических параметрах.
- Он особенно полезен для оценки микроокружения опухолей в исследованиях рака.
- Данный метод обеспечивает более высокую скорость сбора данных по сравнению с традиционными методами.
- Он позволяет использовать более широкий спектр молекул-зондов, чувствительных к окислительно-восстановительному статусу и pH.
Цель исследования
- Для совершенствования методов визуализации в биомедицинских исследованиях.
- Для получения подробной информации о концентрации кислорода, pH и сигнальных молекулах.
- Для углубления понимания микроокружения опухоли.
Используемые методы
- Расчет условий эксперимента для быстрого сканирования.
- Оценка зависимости сигнала от полосы пропускания резонатора.
- Оценка условий эксперимента, таких как ширина диапазона частотного сканирования.
- Применение RS-EPR на частоте 250 MHz с возможностью использования других частот.
Основные результаты
- Демонстрация превосходства RS-EPR над CW-EPR в визуализации.
- Возможность получения большего объема информации за более короткий промежуток времени.
- Успешная визуализация молекул, чувствительных к окислительно-восстановительному статусу и pH.
- Потенциал для более широкого применения в визуализации in vivo.
Выводы
- RS-EPR представляет собой значительный прогресс в методах ЭПР-визуализации.
- Этот метод открывает новые возможности для исследований в области онкологии и других биомедицинских направлений.
- Будущие исследования могут расширить область его применения на различных частотах.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
ЭПР-визуализация с быстрым сканированием позволяет проводить количественную оценку в режиме реального времени таких физиологически значимых параметров, как парциальное давление кислорода, pH, окислительно-восстановительный статус и активные сигнальные молекулы в живых системах. Эта возможность способствует снижению механистических рисков в исследованиях онкологических и воспалительных заболеваний, обеспечивая прямое считывание условий микроокружения, которые влияют на терапевтический ответ и развитие резистентности. Повышенная чувствительность, пространственное разрешение и скорость сбора данных данного метода увеличивают прогностическую достоверность в доклинических моделях, что способствует более раннему принятию решений о целесообразности дальнейшего развития (go/no-go) в процессах валидации мишеней и оптимизации соединений-лидеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования динамики оксигенации, pH и окислительно-восстановительных процессов в моделях, релевантных заболеванию.
- Операционная ценность: обеспечивает количественные, пространственно-разрешенные показатели биомаркеров микроокружения для уточнения активности путей и степени взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет корреляции изменений сигнала зонда с функциональными фенотипами, что повышает достоверность взаимосвязей между мишенью и заболеванием.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные, воспроизводимые спектрально-пространственные изображения молекул-репортеров радикалов, чувствительных к физиологическим стимулам.
- Количественные данные: обеспечивает концентрационно-зависимые изменения сигнала для кислорода, pH и редокс-форм, что позволяет проводить анализ дозозависимого отклика и профилирование ингибиторов.
- Повторное использование платформы: совместима с различными молекулами-зондами (например, BMPO-OH для •OH, нитранил для NO•, триарилметил для pH) в различных экспериментальных установках.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: позволяет напрямую визуализировать гипоксию, ацидоз и окислительный стресс в опухоли — ключевые признаки прогрессирования рака и резистентности к терапии.
- Трансляционная преемственность: связывает механистические данные, полученные на этапе фундаментальных исследований, с доклинической валидацией путем мониторинга одних и тех же биомаркеров в различных моделях.
- Оптимизация разработки с учетом рисков: обеспечивает возможность лонгитюдного отслеживания изменений микроокружения для корректировки графиков дозирования и стратегий комбинированной терапии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
ЭПР со сканированием в быстром режиме (Rapid-scan EPR) вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез относительно мишени и идентификации ведущих соединений до оценки доклинической эффективности, особенно в тех случаях, когда модуляция микроокружения является механизмом действия или фактором резистентности.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем визуализации того, как генетические или фармакологические воздействия изменяют уровни кислорода, pH или окислительно-восстановительные параметры в клеточных и тканевых моделях.
- Скрининг: позволяет разрабатывать методы анализа соединений, модулирующих гипоксический сигналинг, антиоксидантные пути или pH-регулирующие ферменты, с помощью измеряемых сдвигов ЭПР.
- Аналитика: обеспечивает количественные рациометрические измерения интенсивности сигнала зонда и формы спектра, что позволяет проводить сравнение между различными условиями и временными точками.
- Трансляционные исследования: связывают результаты in vitro с данными in vivo путем визуализации тех же радикальных репортеров в фантомах и живых системах.
- Корпоративное использование: функционирует как неразрушающий, готовый к работе модуль визуализации, совместимый с существующими комплексами для доклинической визуализации и адаптируемый к различным химическим составам зондов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет снижения неопределенности вкладов микроокружения в фенотип.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и пропускную способность благодаря более быстрому сбору данных и более высокому соотношению сигнал/шум по сравнению с CW-EPR.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует сортировку портфеля за счет раннего выявления соединений, которые оказываются неэффективными из-за неблагоприятных взаимодействий с микроокружением на начальных этапах разработки.
- Влияние на портфель: Обеспечивает распределение ресурсов с учетом рисков путем приоритизации агентов с благоприятным воздействием на оксигенацию опухоли, нормализацию pH или окислительно-восстановительный баланс.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы в области ЭПР-спектроскопии, химии радикалов и обращения с биологическими образцами.
- Необходим доступ к ЭПР-спектрометру с функцией быстрого сканирования, оснащенному кросс-петлевым резонатором и возможностью создания градиента для 2D-визуализации.
- Требуется стандартизация подготовки зондов, калибровки и контроля условий окружающей среды (температура, влажность) на всех участках исследования.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных радикальных репортеров (например, pH-чувствительных в сравнении с редокс-чувствительными) и типов тканей (фантомы, ex vivo, in vivo).
- Практические ограничения включают стабильность зонда, биодоступность и возможные фоновые сигналы от эндогенных радикалов в сложных биологических матрицах.
