Генерация Индуцированные-плюрипотентных стволовых клеток с использованием фибробластоподобных синовиоциты Выделен из суставов больных ревматоидным артритом
16 октября 2016 г.
Здесь мы опишем протокол для генерации человека наведенного плюрипотентных стволовых клеток из пациента, полученных фибробластоподобных синовиоциты, с использованием лентивирусов системы без фидерных клеток.
Общая цель этого эксперимента заключается в получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или ППК, из фибробластоподобных синовиоцитов, выделенных из синовиальной ткани воспаленного сустава, вызванного ревматоидным артритом. В настоящее время ИПСК могут быть получены из различных первичных клеток человека. Мы успешно получили ИПСК из фибробластоподобных синовиоцитов человека, которые являются ключевыми патологическими клетками ревматоидных суставов.
Это может помочь в исследовании патологии ревматоидного артрита. Это периодическое издание может помочь ответить на ключевые вопросы о вырождении IPSC с использованием RA-FLS. Начните с помещения синовиальной ткани в 100-миллиметровую посуду и промойте ткань 5 миллилитрами PBS с добавлением антибиотиков.
Удалите желтоватую жировую клетчатку и остатки костей. Затем переложите обрезанную ткань в одну лунку из шести лунок, содержащую 5 миллилитров DMEM, дополненного FBS, и с помощью ножниц измельчите ткань до тех пор, пока кусочки не станут достаточно маленькими, чтобы проникнуть в одноразовый наконечник пипетки. Перелейте среду в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, затем добавьте в лунку 5 миллилитров свежего DMEM плюс FBS, чтобы собрать остатки ткани и перенести все содержимое лунки в пробирку.
Далее добавьте в пробирку оттаявшую со льдом коллагеназу до конечной концентрации 0,01% и запечатайте пробирку парапленкой для инкубации на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. Через четыре часа заполните пробирку свежим DMEM плюс FBS до конечного объема 50 миллилитров и соберите фрагменты ткани центрифугированием. Удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу, затем повторно суспендируйте клетки в 40 миллилитрах свежей среды для еще одного центрифугирования.
Повторно суспендируйте вторую гранулу в 25 миллитрах свежего DMEM плюс FBS и дайте большим комочкам ткани осесть. Затем переложите надосадочную жидкость в новую 100-миллиметровую чашку и инкубируйте синовиоциты при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 14 дней. Для расширения культуры синовиоцитов откажитесь от использованной среды и промойте клетки в 5 миллилитрах PBS.
Удалите PBS и диссоциируйте клетки с помощью 1 миллилитра ЭДТА в инкубаторе для клеточных культур в течение 2 минут. В конце инкубации осторожно постучите по чашке, чтобы отделить все оставшиеся прилипшие клетки, и переложите полученную клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в 30 миллилитрах DMEM и FBS и разделите ячейки на 3 новые 100-миллиметровые тарелки.
Кормите синовиоциты свежей средой каждые 3 дня, разделяя клетки на 3 новые культуры при 80% конфлюенции, как показано выше. В нулевой день трансдукции см. 3 x 10 до 4-го FLS на лунку на 6-луночный планшет в свежей питательной среде для ночной инкубации при 37 градусах Цельсия при 5% CO2. На следующий день разморозьте 1 флакон вируса Ленти, содержащий 4 фактора Яманаки, при 4 градусах Цельсия и замените питательную среду FLS питательной средой FLS с добавлением гексадиметрина бромида и аскорбиновой кислоты.
Когда содержимое флакона оттает, добавьте в клетки 30 микролитров лентивируса и аккуратно перемешайте для равномерного распределения вируса. Для улучшения инфекции центрифугируйте планшет и возвращайте клетки в инкубатор, заменяя среду каждый день свежей питательной средой FLS, содержащей бутират натрия и аскорбиновую кислоту в течение 3 дней. На 4-й день замените среду смесью FLS growth и iPSC среды, содержащей бутират натрия и аскорбиновую кислоту.
На 5-й день добавьте 60 микролитров витронектина к 6 миллилитрам PBS без кальция и магния и обмажьте 3 лунки 6-луночной пластины 2 миллилитрами раствора каждая не менее часа при комнатной температуре. Пока витронектин схватывается, промойте трансдуцированные клетки PBS и отсоедините их с помощью ЭДТА, как показано на рисунке. После сбора диссоциированных клеток методом центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 900 микролитрах свежей среды.
Удалите избыток витронектина из лунок и добавьте 300, 150 и 100 микролитров клеток в отдельные лунки. Затем верните клетки в инкубатор, ежедневно заменяя среду свежей iPSC средой до появления колоний. Чтобы выбрать колонии, сначала добавьте 500 микролитров среды iPCS, дополненной ингибитором ROCK, в каждую лунку 48-луночного планшета, покрытого витронектином.
Затем поместите культуры FLS под препарирующий микроскоп на чистом столе и с помощью наконечника пипетки объемом 10 микролитров разрежьте интересующую колонию. С помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров перенесите выбранную колонию в 1 лунку из 48-луночной пластины. Когда все колонии будут собраны, поместите планшет в инкубатор для клеточных культур, пока колонии не станут достаточно большими для переноса.
Разделение клеток, когда колонии находятся вне видимого поля микроскопа, при 100-кратном увеличении. На этом изображении можно наблюдать морфологию выделенной FLS после исходного 14-дневного посева. Клетки проявляют характеристики фибробластов в целом со сходной экспрессией фиброзных маркеров виментина и фибронектина, а также низкой экспрессией макрофагоподобного маркера синовиоцитов CD-68.8 Через 11 дней после лентивирусной трансдукции фактора Яманаки начинают появляться небольшие колонии, которые могут быть выбраны и амплифицированы в течение 5-10 пассажей.
Эти иПСК ревматоидного артрита экспрессируют щелочную фосфатазу, что указывает на то, что они остаются недифференцированными. Клетки также экспрессируют плюрипотентные маркеры, что подтверждено ОТ-ПЦР и иммунофлуоресцентным анализом. Ревматоидный артрит iPCS демонстрируют нормальный хромосомный паттерн 44+XY, определяемый по кариотипированию.
Кроме того, через 12 недель после инъекции мышам с ТКИН у ревматоидного артрита iPSC образовались тератомы, которые демонстрируют различные фенотипы тканей. При этом их дифференциация зародышевого слоя подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием. После освоения iPSC могут быть сгенерированы из FLS с synovium.
После просмотра видео у вас должно быть лучшее понимание того, как изолировать из синовиальной ткани и как индуцировать перепрограммирование с их помощью. Эти ИПСК на основе RAF-FLS могут быть полезны для изучения регенерации или скрининга лекарств в ревматологии. Как только эти ИПСК установлены, могут быть созданы различные виды клеток-мишеней или органов.
Что может быть полезно для изучения болезни или других будущих применений, таких как редактирование генов и так далее.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается протокол получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека из фибробластоподобных синовиоцитов, полученных от пациентов с ревматоидным артритом. Метод основан на использовании лентивирусной системы без применения фидерных клеток, что облегчает изучение патологии ревматоидного артрита.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Ревматология
- Клеточное репрограммирование
Теоретические основы
- Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) могут быть получены из различных первичных клеток человека.
- Фибробластоподобные синовиоциты являются ключевыми патологическими клетками при ревматоидном артрите.
- Понимание процесса получения иПСК из этих клеток может помочь в изучении механизмов заболевания.
- Данное исследование может дать представление о дегенерации иПСК с использованием фибробластоподобных синовиоцитов при ревматоидном артрите (RA-FLSs).
Цель исследования
- Получение иПСК из фибробластоподобных синовиоцитов, полученных от пациента.
- Изучение патологии ревматоидного артрита.
- Разработка протокола, не требующего использования фидерных клеток.
Используемые методы
- Выделение синовиальной ткани у пациентов с ревматоидным артритом.
- Промывка ткани раствором PBS с добавлением антибиотиков.
- Использование лентивирусной системы для репрограммирования клеток.
- Культивирование полученных иПСК для дальнейшего анализа.
Основные результаты
- Успешное получение иПСК из фибробластоподобных синовиоцитов.
- Демонстрация возможности реализации протокола без использования фидерных клеток.
- Потенциал для дальнейших исследований патологии ревматоидного артрита.
- Вклад в понимание дегенерации иПСК с использованием RA-FLS.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод получения иПСК от пациентов с ревматоидным артритом.
- Этот подход может способствовать более глубокому изучению механизмов заболевания и потенциальных методов терапии.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для изучения возможностей применения иПСК в регенеративной медицине.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Генерация специфичных для пациента иПСК из фибробластоподобных синовиоцитов позволяет снизить механистические риски при валидации мишеней при ревматоидном артрите, предоставляя релевантную заболеванию систему для фенотипического скрининга. Данный подход способствует идентификации ведущих соединений с помощью масштабируемых и воспроизводимых моделей, отражающих патофизиологию пациента, что повышает прогностическую достоверность при принятии решений на доклиническом этапе. Этот метод улучшает трансляционную преемственность от этапа поиска до доклинических стадий, обеспечивая валидированные клеточные системы для анализа мишеней и согласования биомаркеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием клеток, полученных от пациентов, которые сохраняют специфические для заболевания генетический и эпигенетический фон.
- Практическая ценность: обеспечивает возобновляемый источник человеческих клеток для функциональной валидации мишеней без зависимости от животных моделей или иммортализованных линий.
- Научная ценность: способствует биологическому снижению рисков, позволяя оценить модуляцию мишени в соответствующем заболеванию клеточном контексте до этапа оптимизации ведущих соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание валидированных биологических систем, подходящих для стандартизации анализов и количественного считывания данных в исследованиях по изучению взаимодействия с мишенью.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимых и масштабируемых клеточных платформ, которые снижают вариабельность при скрининге соединений и обеспечивают согласованность результатов между различными лабораториями.
- Научная ценность: Облегчение подготовки клинически значимых клеток для последующего фенотипического скрининга и кампаний по поиску ведущих соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет патологическую релевантность за счет использования специфичных для пациента иПСК, которые могут быть дифференцированы в синовиальные или хрящевые линии для изучения механизмов заболевания.
- Операционная ценность: Обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации с использованием изогенных клеточных моделей, соответствующих генотипу пациента.
- Научная ценность: Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков, позволяя оценивать эффекты воздействия на мишень в клетках, отражающих воспалительную среду сустава.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых лекарственных средств, предоставляя релевантные заболеваниям клеточные системы для валидации мишеней, разработки анализов и доклинического моделирования, при этом полученные результаты используются для идентификации соединений-лидеров и принятия решений по сортировке портфеля препаратов.
- Открывающая биология (Discovery Biology): обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей с использованием клеток, полученных от пациентов, которые моделируют синовиальную гиперплазию и инвазивность при ревматоидном артрите.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных, масштабируемых культур, полученных из иПСК, которые позволяют проводить количественную оценку клеточных фенотипов.
- Аналитика: предоставляет данные о плюрипотентности и дифференцировке (например, активность щелочной фосфатазы, RT-PCR, иммунофлуоресценция), что помогает сравнивать эффективность репрограммирования и клеточную идентичность при различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом путем получения иПСК, способных к формированию тератом и многолинейной дифференцировке, что подтверждает их применимость для моделирования заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимую возможность получения специфичных для пациента иПСК из синовиальной ткани, применимую для множества образцов пациентов с РА и проектов по валидации мишеней.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет использования релевантных клеточных моделей заболеваний, что снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизация и масштабируемость благодаря лентивирусному репрограммированию без использования фидерных клеток, что упрощает рабочие процессы культивирования.
- Стратегическая ценность: Обоснование более точных решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет возможности ранней оценки эффектов воздействия на мишени в клетках, полученных от пациентов, что снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Приоритезация с учетом рисков за счет использования изогенных пациент-специфических моделей, отражающих реальную патофизиологию заболевания.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения первичных клеток, вирусной трансдукции и культивирования плюрипотентных стволовых клеток.
- Зависит от производства лентивирусных векторов, наличия инфраструктуры биологической безопасности, а также от возможности проведения сортинга клеток с флуоресцентной активацией или микроскопии для отбора колоний.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами в вопросах обработки тканей, мониторинга эффективности репрограммирования и контроля качества линий иПСК.
- При применении протокола к различным образцам синовиальной ткани или состояниям заболеваний, помимо ревматоидного артрита, требуются соответствующие адаптации.
- Ограничено доступностью синовиальной ткани пациентов и временем, необходимым для характеристики и экспансии иПСК перед их последующим использованием.
