Выделение и клеточная Фенотипирование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из синовиальной жидкости и костного мозга карликовых свиней

Общей целью этой процедуры является неинвазивный сбор синовиальной жидкости и костного мозга у минипигов для сбора мезенхимальных стволовых клеток для использования в исследованиях регенерации и иммуномодуляции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области терапии МСК у отологов, например, как установить синовиальную жидкость в МСК и как ее охарактеризовать по сравнению с МСК костного мозга. Основным преимуществом данной методики является эффективное установление ключевых свойств синовиальной жидкости и МСК, полученных из костного мозга от минипигов, которые будут полезны для применения у пациентов.

Применение этого метода распространяется на терапию различных заболеваний суставов, поскольку популяция МСК, происходящих из синовиальной жидкости, в синовиальной полости значительно увеличивается у атлетически активных пациентов. Хотя этот метод может дать представление о регенеративной медицине, он также может быть применен к другим исследованиям, таким как исследование аутоиммунных заболеваний. Поскольку МСК минипигов являются аутологичными, иммуносупрессия может заинтересовать людей.

В дополнение к другим ученым, демонстрировать процедуру будут Ли Хён Чжон и Ли Вон-Джэ с моего третьего уровня. Для начала направьте минипига под наркозом на доступ к гребню подвздошной кости. Далее проведите депиляцию в области площадью 15 квадратных сантиметров на гребне подвздошной кости, используя бритву или машинки для стрижки.

Затем поочередно трижды протрите открытые участки кожи повидон-йодом и 70%-ным этанолом. После полного высыхания наложите стерильные простыни. Теперь предварительно смажьте десятимиллилитровый шприц гепарином, используя трех-четырехмиллилитровый ополаскиватель.

Это предотвратит свертывание костного мозга во время его извлечения. Затем точно на гребне подвздошной кости плотно прикрепите экстрактор костного мозга к шприцу, покрытому гепарином, и извлеките не менее пяти миллилитров костного мозга. Чтобы выделить клетки из извлеченного костного мозга, сначала разведите его с равным объемом DPBS в 15-миллилитровой конической пробирке при комнатной температуре.

Затем загрузите три миллилитра центрифугирующей среды плотности во вторую коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем осторожно перенесите четыре миллилитра разбавленного костного мозга на центрифугирующую среду по плотности для создания слоев из двух растворов. Теперь центрифугируйте пробирку при давлении 400 G в течение 40 минут при комнатной температуре.

Нужные ТНК собираются в центральном белом слое. Отсасывайте именно этот слой. Выбросьте слой MNC в 15-миллилитровую коническую трубку и разбавьте ее семью-восемью миллилитрами DPBS.

Затем центрифугируйте ячейки при давлении 500 G в течение десяти минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, а ячейки на поддонах дважды промойте десятью миллилитрами DPBS, повторив предыдущий цикл центрифугирования. После двух промывок суспензируем ТНК в двух миллилитрах ADMEM.

Затем загрузите клетки на 35-миллиметровую чашку для культуры тканей и инкубируйте их при температуре 38,5 градусов Цельсия во влажном инкубаторе с 5% углекислым газом. Через 48 часов аспирируйте среду вместе с неприкрепленными ТНК. Затем, добавьте обратно два миллилитра свежего ADMEM, и продолжайте инкубацию, меняя среду каждые три дня.

Когда клетки достигнут конфлюенции от 70 до 80%, промойте культуру свежим DPBS. Затем диссоциируйте клетки, используя один миллилитр 0,25% трипсина-ЭДТА в течение трех-пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Соберите клетки в десять миллилитров ADMEM, и перенесите их в 15-миллилитровую коническую трубку.

Затем поверните клетки при давлении 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Теперь суспензируйте собранные ТНК в одном миллилитре свежего ADMEM и измерьте их плотность. В завершение поместите от 1/2 до трех четвертей миллиона клеток в колбы T25 с четырьмя миллилитрами ADMEM.

Инкубируйте колбы так же, как и тарелки, и меняйте среду каждые три дня. Подготовьте участок кожи размером 15х10 сантиметров над бедренным суставом, как это было сделано при подготовке к забору костного мозга. Затем пропальпируйте надколенник и гребни большеберцовой кости ниже кожи, чтобы определить синовиальный сустав, и введите трехмиллилитровый шприц с иглой 23-го калибра точно в сустав.

Используя мягкое отсасывание, извлеките от 1/2 до одного миллилитра жидкости и немедленно извлеките иглу. Если объем синовиальной жидкости слишком мал, то промывайте полость DPBS для сбора синовиальной жидкости с помощью DPBS. Объем используемого DPBS варьируется в зависимости от размера синовиальной полости.

Оптимальный объем синовиальной жидкости ограничен в здоровом суставе. Объем варьируется в зависимости от размера и патологического состояния его сустава. Чтобы изолировать клетки от синовиальной жидкости, разведите жидкость с равным объемом DPBS в 15-миллилитровой конической трубке при комнатной температуре.

Далее мы перемещаем мусор, фильтруя разбавление через 40-микронный сетчатый фильтр из нейлоновых элементов. Затем добавьте еще десять миллилитров DPBS, и центрифугируйте суспензию при 400 G в течение десяти минут при комнатной температуре. Далее выбросьте надосадочную жидкость, и промойте клетки два раза, используя DPBS.

Подвешиваем промытый поддон ячейки в двух миллилитрах ADMEM. Затем приступайте к культивированию клеток, как это было продемонстрировано на примере МСК. МСК были успешно выделены из костного мозга и суставных синовиальных суставов мини-пиг и расширены in vitro.

Морфология МСК, полученных из синовиальной жидкости, аналогична морфологии МСК, полученных из костного мозга: оба имеют форму фибробластического веретена и являются однородно адгезивными. МСК показали положительную экспрессию при окрашивании щелочной фосфатазой после завершения третьей субкультуры. Затем были проанализированы поверхностные маркеры в обеих культурах.

Как и ожидалось, оба типа МСК в значительной степени экспрессировали CD29, CD44 и виментин. Напротив, экспрессия CD34 и CD45 была отрицательной и низкой. Эти результаты были идентичны результатам, полученным с помощью отличительных МСК, включая клетки, выделенные из синовиальной жидкости.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как неинвазивно отсасывать синовиальную жидкость и костный мозг для того, чтобы изолировать их МСК от минипигов и как проводить сравнение и фенотипирование этого МСК. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что целевая точка должна быть расположена на гребне подвздошной кости и синовиальной оболочке, которая определяется тщательной пальпацией. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как на моделях остеоартрита или ревматоидного артрита, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, обладают ли не только МСК костного мозга, но и МСК синовиальной жидкости такой же способностью к инициации хряща или кости и иммуносупрессии.

После своего развития этот метод усовершенствовал аутологичную терапию заболеваний суставов, помогая охарактеризовать МСК, полученные из пораженного или воспаленного сустава у пациентов с артритом.