Выделение и клеточная Фенотипирование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из синовиальной жидкости и костного мозга карликовых свиней

Общая цель данной процедуры заключается в неинвазивном заборе синовиальной жидкости и костного мозга у минипигов для получения мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые будут использоваться в исследованиях по регенерации и иммуномодуляции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области терапии МСК в отологии, такие как способы получения МСК из синовиальной жидкости и их характеристика в сравнении с МСК костного мозга. Основным преимуществом данной методики является возможность эффективно определить ключевые свойства МСК, полученных из синовиальной жидкости и костного мозга минипигов, что будет полезно для применения в клинической практике.

Значение данной методики распространяется на терапию различных заболеваний суставов, поскольку популяция МСК, полученных из синовиальной жидкости в синовиальной полости, значительно увеличивается у пациентов, занимающихся спортом. Хотя этот метод может дать представление о регенеративной медицине, он также может быть применен в других исследованиях, например, при изучении аутоиммунных заболеваний. Поскольку МСК минипигов являются аутологичными, вопросы иммуносупрессии могут представлять интерес для людей.

Помимо других ученых, процедуру будут демонстрировать Хён-Джон Ли и Вон-Джэ Ли с третьего курса. Для начала расположите анестезированную минипиг, чтобы обеспечить доступ к гребню подвздошной кости. Затем удалите волосы на участке площадью 15 см² в области гребня подвздошной кости с помощью бритвы или триммера.

Затем попеременно трижды обработайте открытый участок кожи повидон-йодом и 70% ethanol. После полного высыхания наложите стерильные салфетки. Теперь предварительно обработайте десятимиллилитровый шприц гепарином, используя три-четыре миллилитра для промывки.

Это предотвратит коагуляцию костного мозга во время его извлечения. Затем, точно в области гребня подвздошной кости, плотно прикрепите экстрактор костного мозга к шприцу с гепариновым покрытием и извлеките не менее пяти миллилитров костного мозга. Чтобы изолировать клетки из извлеченного костного мозга, сначала разведите его равным объемом DPBS в 15-миллилитровой конической пробирке при комнатной температуре.

Затем внесите три миллилитра среды для центрифугирования по плотности во вторую коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Далее осторожно перенесите четыре миллилитра разведенного костного мозга на среду для центрифугирования по плотности, чтобы создать два слоя растворов. Теперь центрифугируйте пробирку при 400 Gs в течение 40 минут при комнатной температуре.

Целевые МНК собираются в центральном белом слое. Аспирируйте только этот слой. Перенесите слой МНК в коническую пробирку объемом 15 мл и разбавьте его 7–8 мл DPBS.

Затем центрифугируйте клетки при 500 Gs в течение десяти минут при комнатной температуре. Удалите супернатант и дважды промойте осажденные клетки десятью миллилитрами DPBS, повторив предыдущий цикл центрифугирования. После двух промывок мы суспендируем MNCs в двух миллилитрах ADMEM.

Затем перенесите клетки в чашку для культивирования тканей диаметром 35 мм и инкубируйте их при 38.5 °C в увлажненном инкубаторе с 5% carbon dioxide. Через 48 часов аспирируйте среду вместе с неприкрепившимися MNCs. Затем добавьте 2 мл свежего ADMEM и продолжите инкубацию, меняя среду каждые три дня.

Когда клетки достигнут 70–80% конфлюэнтности, промойте культуру свежим DPBS. Затем диссоциируйте клетки, используя 1 мл 0,25% Trypsin-EDTA в течение трех-пяти минут при 37 °C. Соберите клетки в 10 мл ADMEM и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл.

Затем центрифугируйте клетки при 300 Gs в течение пяти минут при комнатной температуре и удалите супернатант. Теперь суспендируйте собранные MNCs в одном миллилитре свежего ADMEM и измерьте их плотность. Завершите процедуру высевом от 1/2 до трех четвертей миллиона клеток в флаконы T25 с четырьмя миллилитрами ADMEM.

Инкубируйте колбы так же, как и планшеты, и заменяйте среду каждые три дня. Подготовьте участок кожи размером 15x10 см над бедренным суставом, как это делалось при подготовке к забору костного мозга. Затем путем пальпации определите положение надколенника и гребня большеберцовой кости под кожей, чтобы найти синовиальный сустав, и введите трехмиллилитровый шприц с иглой 23G точно в сустав.

С помощью осторожного всасывания извлеките от 1/2 до одного миллилитра жидкости и немедленно выньте иглу. Если объем синовиальной жидкости слишком мал, промойте полость раствором DPBS, чтобы собрать синовиальную жидкость вместе с DPBS. Объем используемого DPBS зависит от размера синовиальной полости.

Оптимальный объем синовиальной жидкости в здоровом суставе ограничен. Объем варьируется в зависимости от размера сустава и его патологического состояния. Для выделения клеток из синовиальной жидкости разведите её равным объемом DPBS в 15-мл конической пробирке при комнатной температуре.

Затем мы удаляем клеточный дебрис, фильтруя разбавленный раствор через нейлоновый клеточный фильтр с размером пор 40 мкм. После этого добавьте еще 10 мл DPBS и центрифугируйте суспензию при 400 G в течение десяти минут при комнатной температуре. Затем удалите супернатант и промойте клетки дважды, используя DPBS.

Осадок промытых клеток суспендируют в двух миллилитрах ADMEM. Затем приступают к культивированию клеток по методике, продемонстрированной для МСК. МСК были успешно выделены из костного мозга и синовиальных суставов минипигов и экспандированы in vitro.

Морфология МСК, выделенных из синовиальной жидкости, схожа с морфологией МСК костного мозга: обе группы имеют фибробластическую веретеновидную форму и гомогенно прикрепляются к субстрату. После завершения третьего субкультивирования МСК продемонстрировали положительную экспрессию при окрашивании на щелочную фосфатазу. Затем в обеих культурах были проанализированы поверхностные маркеры.

Как и ожидалось, оба типа МСК значимо экспрессировали CD29, CD44 и виментин. Напротив, экспрессия CD34 и CD45 была отрицательной и низкой соответственно. Эти результаты были идентичны результатам, полученным для других типов МСК, включая клетки, выделенные из синовиальной жидкости.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как неинвазивно аспирировать синовиальную жидкость и костный мозг для выделения из них MSC минипигов, а также о том, как провести сравнение и фенотипирование этих MSC. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости определения целевой точки на гребне подвздошной кости и в синовиальном суставе путем тщательной пальпации. После выполнения данной процедуры можно применять другие методы, например, на моделях остеоартрита или ревматоидного артрита, чтобы ответить на дополнительные вопросы, в частности, обладают ли MSC из синовиальной жидкости такой же способностью к инициации образования хряща или кости и к иммуносупрессии, как и MSC из костного мозга.

После разработки этот метод позволил продвинуть аутологичную терапию заболеваний суставов, способствуя характеристике МСК, полученных из пораженных или воспаленных суставов пациентов с артритом.