Подход, чтобы усилить согласованность и миелинизации спинного ганглий корень Нейроны

Общая цель этого протокола заключается в улучшении выравнивания аксонов и миелинизации ганглиозных нейронов дорсальных корешков с использованием статической, предварительно растянутой системы культивирования клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инженерии нервной ткани, такие как выравнивание аксонов и увеличение толщины. Основное преимущество этой методики заключается в том, что этот метод с предварительной растяжкой не только усиливает выравнивание аксонов, но и способствует миелинизации.

Чтобы начать эту процедуру, вылейте смесь основания и отвердителя в чашку для культуры тканей. Подержите гелевую смесь под вакуумом в течение 20 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха. Затем поместите гелевую смесь в духовку при температуре 60 градусов Цельсия для созревания на ночь.

После отверждения мембраны PDMS обработайте поверхность кислородной плазмой в системе плазменной очистки и травления в течение трех минут. Впоследствии отрежьте от посуды кусок прямоугольной мембраны. Закрепите его на растягивающейся раме обработанной кислородом стороной вверх.

Затем поместите раму на натяжную сцену и равномерно растяните ее, поворачивая ручку на сцене до тех пор, пока она не достигнет 10% удлинения по более длинной оси. Далее фиксируем натяжку, закручивая винты на раме. После этого снимаем рамку со сцены.

Убедитесь, что поверхность мембраны сухая и очищена от пыли, прежде чем устанавливать на мембрану силиконовую камеру. Позвольте липкой стороне камеры плотно прикрепиться к мембране. Затем простерилизовать поверхность с помощью ультрафиолета в течение 10 минут.

После этого добавьте один миллилитр ФАПЧ на поверхность PDMS в камере в течение шести часов после плазменной обработки. Затем инкубируйте его в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия, прежде чем засеять нейроны DRG для усиления прикрепления клеток. На этом этапе подготовьте стандартную среду для выращивания нейронов DRG.

Перед изоляцией проводят автоклавирование изоляционного оборудования и фильтруют реагенты. Добавьте пять миллилитров изоляционного буфера в одну лунку шестилуночного планшета и положите планшет на лед. Затем приготовьте 10 миллилитров диссоциативной среды, добавив один миллилитр коллагеназы А к девяти миллилитрам 0,05%-ного трипсин-ЭДТА.

Отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,22 микрометра и положите его на лед. После этого принесите в жертву от 10 до 12 крыс возрастом от пяти до семи дней и отрежьте кожу, лежащую над спинным мозгом, с задней части каждой из них. Удалите лишнюю ткань вокруг позвоночника.

Под хирургической лупой сделайте первый разрез с шеи, затем сделайте по одному разрезу вдоль позвоночника с обеих сторон ножницами. Отделите позвоночник от тела щенка и удалите лишние мышцы. Затем разрежьте вдоль длинной оси позвоночника и с помощью пинцета полностью откройте позвоночник, чтобы извлечь спинной мозг.

Далее извлеките ганглий из костяного кармана. Обрежьте нервные корешки и перенесите ганглии в ледяной изоляционный буфер. Соберите примерно от 10 до 16 ДРГ с обеих сторон.

Повторите процедуру вскрытия для остальных щенков. Теперь переложите ДРГ с изоляционным буфером в стерильную 15-миллилитровую пробирку. Дайте ткани осесть на дно трубки и аккуратно удалите изоляционный буфер сверху.

Затем добавьте в пробирку 10 миллилитров диссоциативной среды. Инкубируйте рассеченные ткани в диссоциативной среде на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, встряхивая трубку каждые пять-10 минут. После химической диссоциации центрифугируйте ганглии при температуре четыре градуса Цельсия в течение пяти минут.

Через пять минут достаньте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах стандартной питательной среды и сделайте ее вихрем. Затем еще раз центрифугируйте диссоциированные клетки. Затем удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 12 миллилитрах стандартной питательной среды и сделайте ее вихрем.

Перед посевом клеток удалите раствор ФАПЧ из камеры. Промойте поверхность PDMS стерильной водой и высушите на воздухе. После ресуспензии клеток дайте суспензии постоять одну-две минуты, чтобы мусор остыл на дно трубки.

Далее добавьте по 1,5 миллилитра клеточной суспензии в каждую растянутую камеру и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2. Чтобы устранить глиальные клетки в течение одного дня in vitro, добавьте в каждую лунку по 10 микролитров или 15 микролитров стокового раствора смеси FDU-U. Через семь часов замените эту среду свежей стандартной средой для выращивания и поместите предварительно растянутое устройство для культивирования в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 5% CO2.

В период культивирования клеток меняйте среду каждые два дня, заменяя половину отработанной среды свежей средой. При этой процедуре извлеките питательную среду из шванновских клеток и добавьте в колбу пять миллилитров 0,05% Трипсина-ЭДТА. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% CO2 в течение двух-трех минут.

Проверьте клетки под оптическим микроскопом с помощью объектива с 10-кратным увеличением, чтобы увидеть, поднимаются ли они из колбы. Затем добавьте пять миллилитров питательной среды к ячейкам в колбе и перемешайте. Впоследствии добавьте клеточную суспензию в 15-миллилитровую центрифужную пробирку и центрифугируйте при температуре 20 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Затем удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в семи миллилитрах стандартной питательной среды DRG. После этого перелейте 10 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитров. Смешайте его с 10 микролитрами трипанового синего и затем подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра с помощью объектива 10X.

Добавьте питательную среду DRG для разведения клеточной суспензии до 5 000 клеток на миллилитр. Далее извлеките 0,5 миллилитра среды из культуры DRG в растянутой камере и добавьте в культуру DRG 0,5 миллилитра суспензии шванновских клеток. Культивируйте клетки в течение одной недели при температуре 37 градусов Цельсия в 5% CO2.

Меняйте среду каждые два дня, заменяя половину отработанной среды свежей стандартной средой для выращивания. После культивирования на растянутых и нерастянутых поверхностях в течение двух недель очищенные шванновские клетки добавляли в камеру и культивировали в течение еще одной недели. Здесь показано окрашивание тубулином бета-III для аксонов на растянутой поверхности.

И это наложение бета-III тубулина и окрашивания P0 на растянутую поверхность, что позволяет предположить, что шванновские клетки прикреплены к аксонам и, вероятно, миелинизируют их. На этом изображении показано окрашивание тубулина бета-III для аксонов на нерастянутой поверхности. А наложение бета-III тубулина и окрашивания P0 на нерастянутую поверхность говорит о том, что шванновские клетки не прикреплены к аксонам.

После освоения этой техники ее можно выполнить за три-четыре часа, если она выполнена правильно. При проведении этой процедуры важно помнить, что мембрана PDMS должна быть плоской и иметь однородную толщину. После этой процедуры можно использовать распылители, такие как предварительно растянутые микроканалы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как аксон, линза и миграция шванновских клеток.

После его разработки этот метод проложит путь исследователям в области тканевой инженерии к изучению роли поверхностной анизотропии в регенерации нервов в спинном мозге и седалищном нерве. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как индуцировать выравнивание аксонов и миелинизацию с помощью предварительно растянутого устройства.