Stripe Assay по изучению притягательные или отталкивающие активность белка подложки с использованием диссоциированных нейронах гиппокампа

Общая цель метода полос (stripe assay) заключается в оценке способности специфических белков, таких как молекулы наведения, привлекать или отталкивать нейроны. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области наведения аксонов, например, о том, как нейроны мигрируют или продлевают свои аксоны в ответ на воздействие внешней клеточной среды. Основным преимуществом данной методики является возможность визуализации большого количества нейронов в рамках одного эксперимента и одновременного анализа множества конусов роста.

Для подготовки прокипятите от четырех до восьми силиконовых матриц в воде в течение пяти минут. Дайте им полностью высохнуть на воздухе в ламинарном шкафу полосатой стороной вверх. Это занимает около одного часа.

Продолжите работу в вытяжном шкафу. Используйте сжатый воздух или липкую ленту, чтобы удалить пыль с полосатой стороны матриц. Затем осторожно поместите каждую матрицу в отдельную пластиковую чашку диаметром шесть сантиметров полосатой стороной вниз.

Плотно прижмите каждую матрицу одним пальцем. Избегайте образования пузырьков воздуха между матрицей и чашкой. Если матрица не прикрепилась, повторите процедуру.

После прикрепления отметьте расположение полос на нижней стороне чашки для культивирования. Подготовьте рекомбинантные белки с флуоресцентной меткой в PBS. Приготовьте по 25 µL для каждой чашки с полосами.

Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем в каждую лунку с помощью шприца с иглой 22G введите 25 µL разведенного белка через небольшое отверстие в боковой части матрицы. Избегайте попадания пузырьков воздуха в матрицы, так как они могут нарушить связывание белков с поверхностью лунок.

Теперь инкубируйте планшеты в течение 30 минут при 37 °C в инкубаторе для культур клеток. После инкубации внесите 300 µL PBS в верхнюю прорезь каждой матрицы. Затем аспирируйте PBS через маленькое отверстие, расположенное сбоку каждой матрицы, чтобы удалить все несвязавшиеся рекомбинантные белки.

Не аспирируйте PBS полностью, чтобы белки не пересохли. Повторите промывку PBS в общей сложности три раза. Затем осторожно удалите матрикс из каждой чашки.

Затем немедленно добавьте около 100 µL контрольного белка на всю полосатую область, создавая чередующееся покрытие в каждой лунке. Далее инкубируйте лунки в течение 30 минут при 37 °C. Тем временем на льду разморозьте ламинин и PBS в концентрации 20 µg/mL.

Через 30 минут трижды промойте чашки PBS. Затем нанесите в каждую чашку около 100 мкл холодного ламинина и верните чашки в инкубатор еще на один час. Через час снова трижды промойте чашки с помощью PBS.

После третьей промывки добавьте примерно 150 µL культуральной среды в каждую чашку. Затем инкубируйте чашки в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C до следующего этапа использования. После эвтаназии мыши-донора на стадии E15.5 сделайте сагиттальный разрез кожи и черепа по средней линии головы хирургическими ножницами и извлеките мозг с помощью микрошпателя.

Осторожно перенесите мозг в чашку Петри объемом 60 миллилитров, содержащую три миллилитра HBSS. С помощью скальпеля вырежьте из мозга полушария, включая кору, гиппокамп и стриатум. Затем препарируйте области гиппокампа, осторожно удалив мозговые оболочки.

Перенесите выделенные ткани гиппокампа в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую два миллилитра раствора HBSS на льду. Шести гиппокампов от трех эмбрионов достаточно для культивирования нейронов в восьми чашках. После сбора всех тканей гиппокампа аспирируйте HBSS и замените его двумя миллилитрами трипсина-ЭДТА.

Затем инкубируйте пробирку в течение 15 минут на водяной бане при 37 °C. Далее нейтрализуйте активность трипсина, добавив 500 µL фетальной бычьей сыворотки. Затем центрифугируйте смесь при 100 ×g в течение пяти минут.

Удалите супернатант и промойте осадок двумя миллилитрами культуральной среды. Затем снова центрифугируйте смесь и замените среду новой порцией среды. Теперь диссоциируйте ткань путем осторожной тритурации, используя наконечник дозатора на один миллилитр с обрезанным кончиком.

Пропускайте ткани вверх и вниз через кончик наконечника дозатора примерно 10 раз. Затем возьмите неразрезанный наконечник объемом 1 мл и повторите тритурацию до получения суспензии единичных клеток. После этого выделите единичные клетки, пропустив суспензию через ячеистый фильтр с размером пор от 80 до 100 микрон.

Затем центрифугируйте отфильтрованную суспензию при 150 Gs в течение пяти минут, аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок в двух миллилитрах культуральной среды. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и высейте 10 000 нейронов в 150 µL культуральной среды на каждую подготовленную полосатую подложку. Осторожно внесите суспензию так, чтобы она покрывала всю полосатую область.

Диссоциированные нейроны гиппокампа мышей стадии E15.5 высевали и культивировали в течение 24 часов на полосах флуоресцентно меченного контрольного белка FC, либо нейроны высевали на чередующиеся полосы FLRT2 FC и немеченного контрольного FC. В обоих случаях нейроны агрегировали и продлевали свои аксоны в виде пучков. На контрольном FC нейроны распределялись равномерно и продлевали аксоны в случайных направлениях. Напротив, при культивировании с полосами FLRT2 FC аксоны избегали роста в областях FLRT2 FC.

Таким образом, растущие аксоны развивались преимущественно на полосах FC. При большем увеличении видно, что аксоны росли вдоль границы с полосами FLRT2 FC, но не прорастали в область FLRT2. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как создавать полосатый ковер из рекомендуемых белков и оценивать привлекающую или отталкивающую активность с помощью диссоциированных нейронов гиппокампа.

После освоения эта методика может быть выполнена за пять часов при условии правильного ее проведения.