Выделение Giant хромосомы типа ламповых щёток из живых ооцитов Лягушки и саламандры

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать гигантское ядро, или зародышевый пузырь, от ооцита амфибии и распределить хромосомы ламповой щетки и другие ядерные органеллы на предметном стекле микроскопа для иммуноокрашивания, гибридизации in citu и других молекулярных методов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы об основной структуре хромосом, ядрышек и других ядерных органелл, а также о молекулярных деталях транскрипции, сплайсинга и экспорта РНК. Основным преимуществом этого метода является легкость, с которой структура хромосом и транскрипция могут быть исследованы с помощью обычной световой микроскопии, с использованием иммунофлуоресценции, гибридизации in citu и других молекулярных методов.

Демонстрировать процедуру будет доктор Зехра Низами, постдок из моей лаборатории. После приготовления всех требуемых растворов соберите луночные горки, состоящие из подложных, стеклянных стекол, к которым пластиковые лунки были прикреплены с помощью парафина, как это обсуждается в текстовом протоколе. Затем соберите ткань яичника, предварительно собранную у взрослой особи, самки лягушки или саламандры, и заполните небольшую чашку Петри питательной средой для ооцитов.

Затем поместите в эту пластину часть изолированной ткани, содержащую примерно от 10 до 20 ооцитов. Затем определите одну яйцеклетку и с помощью двух пар щипцов ювелира отрежьте стебель, который соединяет его со стенкой яичника. Как только ооцит освободится, перенесите его в новую чашку Петри, содержащую зародышевый везикул, или GV, изоляционную среду.

При малом увеличении найдите животный полюс ооцита, который можно определить по темной окраске. Затем с помощью щипцов проделайте большое отверстие рядом с животным полюсом и приступайте к осторожному выдавливанию прозрачного ядра ооцита, также называемого GV. После этого откатайте GV подальше от любого желтка, который также был выдавлен. Чтобы удалить желток, который остается плотно прилипшим, втягивайте ядро внутрь и из пипетки с наконечником, диаметром которого немного больше, чем у GV. После сбора лягушки ГВ немедленно переведите ее в диспергирующую среду, чтобы предотвратить ядерное закаливание, которое помешало бы последующим этапам.

Затем с помощью двух пар щипцов возьмитесь за ядерную оболочку в верхней части GV, стараясь не надавить. Все еще сжимая конверт, продолжайте раздвигать два щипца и ожидайте, что содержимое ядра выскочит наружу. Чтобы собрать это содержимое, сначала подготовьте регулируемую пипетку объемом 20 микролитров с отрезанным наконечником, как описано в текстовом протоколе.

Затем из чашки приступайте к набору пяти микролитров диспергирующей жидкости, а затем пяти микролитров раствора с содержимым GV. После того, как это содержимое будет собрано, переложите его на предметное стекло, заполненное диспергирующим раствором. Убедитесь, что жидкость в предметном стекле имеет выпуклую поверхность, чтобы избежать скопления пузырьков на последующих этапах.

После этого установите на лунку 18-миллиметровую защитную крышку и поместите собранное предметное стекло во влажную камеру на 10-60 минут. В течение этого времени следует ожидать, что ядерный гель будет медленно рассеиваться, так что хромосомы и ядерные органеллы окажутся на поверхности стекла. После удаления ядра из ооцита саламандры оставьте его в изоляционной среде.

Обратите внимание, что саламандры GV, в отличие от используемых здесь видов лягушек, не будут чрезмерно затвердевать в этом растворе. Удалите ядерную оболочку с саламандры GV, используя ту же технику на основе щипцов, которая описана для лягушек. Затем соберите слегка гелеобразное ядерное содержимое с помощью пипетки с разрезанным наконечником и перенесите гель в чашку Петри, содержащую диспергирующий раствор.

Быстро промойте пипетку в диспергирующем растворе, и используйте его для сбора ядерного геля. Затем введите гель в лунное горло, добавьте покровный лист и дайте гелю разойтись, как описано ранее. Затем используйте фазовый контраст для просмотра ядерного содержимого и определите хромосомы ламповой щетки, сокращенно LBC, по их большому размеру и парным боковым петлям.

Убедившись, что LBC не повреждены, подготовьте предметное стекло к центрифугированию, поместив лист фильтровальной бумаги на защитный лист. Затем надавите, чтобы удалить лишнюю жидкость из камеры. Далее добавьте вазелин на каждый край покровного стекла.

Нагрейте металлический стержень примерно до 70-80 градусов Цельсия и используйте его, чтобы расплавить желе и запечатать защитное стекло на нижнем пластике. Повторите эту процедуру для других слайдов с LBC хорошего качества. После того, как все защитные стекла будут закреплены, поместите ползуны в держатели для центрифугирования и убедитесь, что противоположные держатели сбалансированы.

Используя функцию медленного запуска, центрифугируйте предметные стекла, как описано в тексте, с помощью специально изготовленных носителей. В качестве альтернативы можно использовать стандартную настольную центрифугу, в которой предметные стекла прикрепляются к пластине и вращаются. Чтобы подготовить ядерное содержимое к иммуноокрашиванию или гибридизации in citu, сначала протрите временную вазелиновую пломбу лезвием бритвы, а затем поместите предметное стекло в стойку стандартной чашки для окрашивания предметными стеклами.

Затем добавьте достаточное количество параформальдегида, чтобы покрыть предметные стекла. При погружении в воду с помощью тупых щипцов снимите и выбросьте каждое чехло. Оставьте предметные стекла в фиксирующем состоянии на 15-30 минут.

После фиксации поместите предметное стекло в чашку для окрашивания, содержащую ледяной PBS. Затем вставьте острое лезвие бритвы в край пластикового квадрата, и хорошенько подденьте этот пластик. После того, как этот процесс будет повторен для всех слайдов, приступайте к окрашиванию, как описано в текстовом протоколе.

На этом изображении в темном поле показано ядерное содержимое одного аксолотля GV в профазе первого мейотического деления, собранное и приготовленное с использованием описанного протокола. Видны 14 больших парных ЛБК, а также амплифицированные ядрышки. Дополнительное окрашивание этого препарата антителом против фоспорилированной РНК-полимеразы II, показанное здесь зеленым цветом, позволяет выявить расположение тел локуса гистонов, а также дает представление об устойчивой транскрипционной активности этих хромосом ооцитов.

Более высокое увеличение LBC одного аксолотля, в данном случае окрашенного в зеленый цвет для РНК-полимеразы и синий для ДНК, демонстрирует наиболее уникальную морфологическую особенность этих хромосом. Сотни парных боковых петель, каждая из которых представляет как минимум одну единицу транскрипции, активно синтезирующую РНК. Сравнение с аналогичным образом окрашенным LBC, полученным при том же увеличении, подчеркивает огромную разницу в размерах между хромосомами лягушки и саламандры, которая коррелирует с общим содержанием ДНК в геномах используемых видов.

Тем не менее, даже в хромосоме лягушки отдельные единицы транскрипции можно рассматривать как петли хроматина, выступающие латерально от оси хромосомы, как показано на этом изображении с большим увеличением. Ооциты рыб, птиц, рептилий и некоторых беспозвоночных также содержат гигантские хромосомы ламповых щеток. Примечательно, что хромосомы ламповых щеток образуются, когда головки сперматозоидов других организмов, включая человека, вводятся в зародышевый пузырь амфибии.

После освоения технологии партия спредов AGV может быть приготовлена за один час, а затем центрифугирована и зафиксирована в течение еще одного-двух часов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить ГВ и распределить хромосомы ламповой щетки для дальнейшего изучения с помощью молекулярных зондов.