Быстрой стратегия для выделения новых Faustoviruses из проб окружающей среды Использование

Общая цель этой новой стратегии изоляции заключается в том, чтобы расширить количество новых изолятов вирусов для изучения пангенома этого нового семейства вирусов, а также для лучшего понимания их экосистем и потенциальной патогенности для человека. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области вирусологии и помочь вирусологам по всему миру, заинтересованным в поиске гигантских вирусов и, в частности, фаустовирусов. Основным преимуществом этой методики является совершенствование многих этапов, таких как состав смеси антибиотиков и противогрибковых средств, новая среда голодания, адаптированная для амеб, и использование проточной цитометрии для более быстрого и чувствительного обнаружения лизиса. После сбора проб грязной воды в соответствии с текстовым протоколом подготовьте клетки-хозяева V. vermiformis, поместив амеб в культуральный флакон площадью 75 см² с 30 мл среды с протеоз-пептоном, дрожжевым экстрактом и глюкозой (среда PYG) и инкубируя при 28 °C в течение 48 часов. Используйте счетные камеры для подсчета амеб, и когда они достигнут концентрации от 5×10⁵ до 10⁶ клеток на мл, соберите клетки путем центрифугирования при 720 ×g в течение 10 минут.

Оснимите супернатант и используйте 30 миллилитров стерильного физиологического раствора Пейджа (Page's amoebal saline, PAS) для ресуспендирования осадка амеб. После повторного промывания осадка используйте 30 миллилитров среды для голодания, содержащей антибиотик и противогрибковое средство, чтобы ресуспендировать клетки до концентрации примерно 10⁶ амеб на миллилитр. Среда для голодания позволяет амебам оставаться живыми без образования цист или размножения.

Затем внесите по 200 мкл амеб в лунки 96-луночного планшета с плоским дном и инкубируйте при 30 °C в течение 30 минут. После этого, перемешав пробы воды на вортексе в течение одной минуты при комнатной температуре, инокулируйте по 25 мкл каждого образца на клетки амеб, оставив две лунки без образца в качестве отрицательного контроля. Для предотвращения испарения поместите планшет с первичной культурой в пакет с влажным компрессом, а затем поместите увлажненную камеру с планшетом в инкубатор при 30 °C.

Через три дня после первой инокуляции перенесите культуру с первой чашки в новый 96-луночный планшет с амебами, как показано выше, без предварительного микроскопического исследования. Инкубируйте при 30 °C в течение трех дней. Затем, используя полученную субкультуру, инокулируйте третий планшет, как описано ранее, и инкубируйте в течение двух дней.

Для обнаружения лизиса в финальной планшете с совместным культивированием включите цитометр и выполните очистку и промывку в соответствии с протоколом производителя для снижения уровня фонового шума. Для проведения полностью автоматизированного сбора данных в течение 40 минут запустите высокопроизводительный пробоотборник (HTS) для автоматической загрузки образцов из 96-луночного планшета согласно протоколу производителя. Установите параметры HTS следующим образом: объем образца 150 µL, объем перемешивания 50 µL, скорость перемешивания 180, количество перемешиваний 5, объем промывки между образцами 400 µL, скорость потока 2,5 µL/s и количество регистрируемых событий 10 000. Нажмите кнопку home, чтобы HTS мог определить положение планшета. Затем сначала оцените лунки с отрицательным контролем, содержащие клетки амеб-хозяев, чтобы выделить популяцию амеб и определить процент клеток в соответствии с их физическими характеристиками. Убедитесь, что имеется гомогенная популяция амеб и вторая популяция с меньшим количеством событий, соответствующая клеточному дебрису и шуму. Затем начните выделение популяций, нажав acquire sample.

Затем с помощью стрелки, определяющей гейты, локализуйте интересующую популяцию амеб. После установки гейта на 10 000 и более событий нажмите «run» (запуск), чтобы система HTS автоматически обработала весь планшет. Выполните сбор и анализ данных согласно параметру прямого светорассеяния (forward scatter), определяющему размер, и параметру бокового светорассеяния (side scatter), определяющему структуру. Дополнительные сведения см. в тексте.

После обнаружения лизиса методом проточной цитометрии, дозированно перенесите лизированные ко-культуры пипеткой, чтобы суспендировать оставшихся амеб. Перенеся по 50 µL каждого образца на предметные стекла, подвергните суспензию прямому цитоцентрифугированию при 800 ×g в течение 10 минут.

Затем используйте чистый метанол для фиксации предметных стекол, после чего оставьте их высыхать при комнатной температуре. После фиксации трижды погрузите стекла в раствор ESN на четыре секунды каждое, а затем поместите стекла в раствор синего азура на шесть секунд. В завершение погрузите стекла в PBS на 45 секунд.

Оставьте стекла высыхать при комнатной температуре перед началом наблюдения. Для окрашивания новых фиксированных препаратов DAPI внесите пипеткой 15 µL DAPI на сухие стекла. Осмотрите стекла под световым микроскопом при увеличении 1000x, чтобы проверить наличие вирусных фабрик.

Для проведения электронной микроскопии нанесите 5 µL положительного образца на подложку с 글로у-разрядом и инкубируйте при комнатной температуре примерно 20 минут. Осторожно высушите подложку, затем добавьте небольшое количество 1% молибдата аммония и инкубируйте в течение 10 секунд. После аккуратного удаления капли дайте подложке высохнуть в течение пяти минут. Далее установите ускоряющее напряжение электронного микроскопа на 200 keV. Затем поместите подложку в держатель и введите держатель в микроскоп. Нажмите на иконку обзора вакуума и проверьте уровень вакуума. Затем закройте клапаны, установите размер пятна на пять и увеличение 25 000 перед началом наблюдения. После обнаружения гигантского вируса на экране захвата используйте инструмент измерения, чтобы измерить размер вируса.

Проведите молекулярно-биологический анализ и секвенирование вирусного генома в соответствии с текстовым протоколом.

На этом рисунке представлены результаты детекции двух Faustoviruses в сравнении с надежными отрицательными контролями. Отрицательный контроль лизиса содержал популяцию амеб в количестве 86%. Напротив, более 60% амеб подверглись лизису, при этом наибольший процент клеточного дебриса наблюдался в положительных образцах.

Как видно здесь, окрашивание ESN и blue-azur выявляет ядра неинфицированных и инфицированных клеток амеб, а также наличие вирусных фабрик внутри инфицированных клеток. Окрашивание DAPI также подтверждает наличие вирусных фабрик внутри амеб. На этих изображениях электронная микроскопия обнаруживает Faustovirus с типичным видом мегавируса, состоящего из икосаэдрического капсида без фибрилл и имеющего размер 200 nanometers.

После освоения методики и завершения совместного культивирования процедура обнаружения лизиса и характеристики вирусов может быть выполнена за час при условии ее правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости контроля жизнеспособности амеб и проверки на возможные контаминации. После проведения данной процедуры могут быть применены другие методы, например, методы молекулярной биологии, направленные на изучение гигантских вирусов, для получения ответов на дополнительные вопросы, такие как определение семейства или генотипа вируса.

После своей разработки этот метод открыл исследователям в области вирусологии путь к изучению этого семейства вирусов, их специфических хозяев и их потенциальной патогенности. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как легко изолировать гигантские вирусы, увеличив количество и разнообразие образцов, а также подобрав оптимальную клетку-хозяина и лучшие условия культивирования. Не забывайте, что работа с вирусами, потенциально патогенными для человека, может быть чрезвычайно опасной, особенно при использовании образцов сточных вод.

Таким образом, при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать такие меры предосторожности, как работа в лабораториях уровня SB2 с соблюдением условий безопасности.