Доставки терапевтических миРНК в ЦНС с использованием катионных и анионных липосом

Общая цель этой процедуры заключается в разработке системы доставки, которая может доставлять низкомолекулярные препараты, такие как миРНК, в мозг. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области нейродегенерации, такие как: является ли миРНК жизнеспособным терапевтическим вариантом для лечения заболеваний, связанных с неправильным сворачиванием белка? и Можем ли мы разработать надежную систему доставки лекарств в мозг?

Основное преимущество создания липосомальной системы доставки лекарств заключается в том, что мы можем доставлять нашу миРНК внутривенно или через кровоток, а не напрямую через нейронную ткань, что приводит к повреждению нейронов. Применение этого метода распространяется на терапию и диагностику нейродегенеративных заболеваний, поскольку этот метод позволяет осуществлять специфическую доставку через гематоэнцефалический барьер, в частности, к нейронам, экспрессирующим ацетилхолин. Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение, поскольку инъекции в хвостовую вену мыши трудно освоить из-за небольшого размера хвостовой вены мыши.

Начните с приготовления индивидуального соотношения ДОТАП к холестерину. Для получения препарата липосомы инородного животного происхождения смешайте два наномоля ДОТАП и два наномоля холестерина с десятью миллилитрами раствора хлороформа к метанолу один к одному. Затем испарите девять миллилитров раствора хлороформа и метанола с помощью газообразного азота.

Выпарить последний один миллилитр растворителя в вытяжном шкафу на ночь без газа. На следующий день на дне колбы должна быть видна тонкая липидная пленка. Нагрейте обе эти колбы с липидной пленкой и десятью миллилитрами десятипроцентного раствора сахарозы до 55 градусов Цельсия.

нагретый раствор сахарозы на тонкую липидную пленку, осторожно поворачивая колбу. Далее соберите экструдер с фильтрами в один микрон согласно инструкции производителя. Затем добавьте один миллилитр подогретой липосомальной суспензии в один из шприцев на экструдере.

Затем проведите суспензию между двумя шприцами 11 раз. Поддерживая липосомную суспензию в подогреве для облегчения определения размера, размерите липосомы до 45 микрон и используйте фильтр 2 микрона. Чтобы получить большие однослойные везикулы, затем добавьте 20 микролитров суспензии липосом четырех наномолей к 200 микролитрам 20 микромольного раствора миРНК и инкубируйте в течение десяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте 80 микролитров из 500 микромолярного запаса пептида нацеливания RVG-9R в раствор липосомы миРНК и инкубируйте в течение десяти минут при комнатной температуре.

Приготовьте суспензию липсоэ инородного животного происхождения, смешав 2,2 наномоля DSPE или DOTAP с десятью миллилитрами раствора хлороформа и метанола в соотношении два к одному с 1,6 наномолями холестерина и 2 наномолями DSPE PEG. После этого нанесите газообразный азот и, когда большая часть растворителя испарится, оставьте колбу в вытяжном шкафу на ночь. Затем медленно добавьте десять миллилитров 1X PBS, нагретых до 75 градусов Цельсия, в тонкую липидную пленку.

Дайте липидам регидратироваться при температуре 75 градусов Цельсия в течение как минимум одного часа перед калибровкой. После калибровки липосомальной суспензии с помощью экструдера, как и раньше, пипетку 20 микролитров каждой из четырех наномосомных липосомальных суспензий в одноразовые аликвоты и лиофилизацию в течение 30 минут с помощью настольной сублимационной сушилки. Затем добавьте 1,4 микролитра 26,6 микромольного раствора протамина сульфата к 200 микролитрам 20 микромолярного стокового раствора миРНК и инкубируйте в течение десяти минут при комнатной температуре для конденсации миРНК.

После инкубации регидратируйте подошвы DSPE с 201,4 микролитрами раствора протамина миРНК. Регидратируйте подошвы ДОТАП 200 микролитрами раствора миРНК чужеродного животного происхождения. Инкубируйте раствор миРНК каждой липосомы в течение десяти минут при комнатной температуре.

Далее добавьте десять микролитров 60 миллимолярного раствора EDC в каждую пробирку регидратированных липосом. Затем добавьте десять микролитров 150 миллимолярного раствора сульфо-NHS в раствор миРНК липосомы для палетов DOTAP и DSPE. Выдерживать в течение двух часов при комнатной температуре.

Наконец, добавьте 80 микролитров 500 микромолярного запаса пептида RVG-9R в сшивающий раствор липосомы миРНК и инкубируйте в течение десяти минут при комнатной температуре. После обезболивания мыши с использованием двух-трехпроцентного изофлурана в кислороде покройте глаза мыши аптальмологической мазью и подтвердите обезболивание выполнением прищипывания пальцев ног. Приступайте только в том случае, если реакция отсутствует.

Во время анестезии положите мышь на спину или бок, чтобы получить доступ к хвостовой вене. Протрите хвост 70-процентным этанолом, а затем с помощью инсулинового шприца 26-го калибра введите 300 микролитров LSPC или палетов в хвостовую вену. Начните инъекцию дистально и двигайтесь проксимально, если вена лопнула или разорвалась.

Поместите мышь в чистую клетку до тех пор, пока она не перестанет лежать на грудине. Наблюдайте за животным в течение нескольких часов после инъекции, чтобы убедиться, что анестезия ослабла и нет побочных эффектов лечения. Дав LSPC или сосочкам циркулировать в течение не менее 24 часов, а затем усыпив мышь, рассеките половину полушария мозга.

Затем поместите половину полушария и 2,5 миллилитра факс-буфера на сетчатый сетчатый фильтр размером 40 микрон и с помощью поршня шприца выдавите ткань через фильтр в чашку Петри. Промойте сетчатое фильтр и чашку Петри еще 2,5 миллилитрами буфера для факса. Затем переложите одноклеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и положите на лед.

Затем пипетируйте 100 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте в течение пяти минут при 350-кратной G. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре факс-буфера и снова центрифугируйте. Затем добавьте еще один миллилитр буфера для факса и поместите суспензию ячейки на лед. Теперь инкубируйте клетки в 100 микролитрах антимышиного Fc-блока крысы в факс-буфере на 30-60 минут на льду.

После гранулирования и промывания, как и раньше, добавьте 100 микролитров флуоресцентного первичного раствора антител и положите на лед на 30-60 минут. После окончательной промывки повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре буфера для лизиса RVC на одну минуту. Затем гранулируйте клетки.

Выбросив буфер, снова суспендируйте в одном миллилитре факс-буфер и положите на лед. Теперь ячейки готовы к анализу факсов. У мышей, получавших миРНК, доставленные через LSPC, наблюдалось значительное снижение уровня клеточного прионного белка по сравнению с контролем PBS, что свидетельствует о типе клеточного прионного белка.

Мыши, получавшие LSPC, показали уровни клеточного прионного белка, близкие к уровню мышей с нокаутом прионного белка. В трех экспериментах мыши, получавшие LSPC, показали значительное снижение уровня клеточного прионного белка по сравнению с PBS в контрольной группе. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что липосомы могут храниться в холодильнике в течение нескольких месяцев, но полные LSPC должны быть использованы в течение 24 часов после сборки.

После его разработки поколение LSPC или поддонов проложит путь для исследователей к изучению дополнительных терапевтических вариантов в области нейродегенеративных заболеваний.