Обнаружение иконографии в естественных условиях , CaspaseTracker биосенсор

Общая цель этой процедуры заключается в обнаружении и отслеживании обратного процесса гибели клеток после активации каспазы у живых животных с использованием Drosophila melanogaster в качестве модели. В ответ на стимул смерти клетки подвергаются запрограммированной гибели, такой как апоптоз, который традиционно рассматривается как необратимый каскад, ведущий к гибели клеток. Интересно, однако, что после устранения стимула смерти некоторые умирающие клетки могут обратить вспять процесс клеточной смерти даже на поздней стадии.

Благодаря недавно открытому феномену восстановления клеток, называемому анастазом. Живая клеточная микроскопия показывает, что апоптотические умирающие клетки демонстрируют уникальные морфологические признаки, такие как блеббинг плазмидной мембраны, ядерная конденсация и усадка клеток. В общем, ожидается, что эти клетки погибнут.

Однако после промывания и инкубации отмирающих клеток со свежей средой они подвергаются анастазу, восстанавливаются и в дальнейшем могут делиться. Обнаружить и отследить анастаз у живых животных сложно, потому что восстановленные клетки могут быть морфологически неотличимы от окружающих здоровых клеток. Для решения этой проблемы была разработана биосенсорная система CaspaseTracker у млекопитающих, которая идентифицирует и отслеживает клетки, которые обращают вспять процесс гибели клеток после казни или активации каспаз, что является отличительным признаком апоптоза.

Эта биосенсорная система состоит из двух компонентов: трансактиватора, активируемого каспазой, rtTA, и репортера активности rtTA на основе Cre LoxP. В здоровых клетках, не обладающих активностью каспазы, rtTA связывается с якорем плазматической мембраны через расщепляемый каспазой линкер DEVD. Поскольку привязанный rtTA не может транслоцироваться из цитозоля в ядро, репортер rtTA остается неактивным.

Однако при активации в ответ на индукцию клеточной смерти каспазы расщепляют линкер DEVD, освобождая rtTA для транслокации в ядро для активации репортера rtTA. Оказавшись в ядре, rtTA связывается с элементом ответа tet, или TRE, и запускает переходную экспрессию Cre-рекомбиназы, что приводит к необратимому событию рекомбинации, которое удаляет кассету стоп-кодона между промотором CAG и кодирующими последовательностями красного флуоресцентного белка DsRed. Это приводит к постоянной экспрессии DsRed, который служит постоянным флуоресцентным маркером для клеток, которые могут оставаться живыми после того, как они испытали активность каспаз, а также для их потомства.

Конфокальная микроскопия живых клеток показывает, что после индукции транзиторной клеточной смерти биосенсорные клетки CaspaseTracker экспрессируют DsRed во время и после их восстановления, и, следовательно, отличают их от невосстановленных клеток, обозначенных белыми стрелками, а также контрольных биосенсорных клеток, которые не подвергались воздействию стимула клеточной гибели. Запрограммированная клеточная смерть, такая как апоптоз, обычно считается необратимой, потому что она осуществляется путем безудержного и массивного клеточного разрушения. Тем не менее, мы обнаружили, что эта умирающая клетка может фактически восстановиться даже на поздней стадии, которая считается точкой невозврата, например, после высвобождения цитохрома с, активации каспазы-3, повреждения ДНК, блеббинга плазматической мембраны, усадки клеток и образования апоптотических тел.

Мы назвали эти процессы обращения вспять процесса клеточной смерти anastasis, что в переводе с греческого означает «воскресение». С помощью микроскопии живых клеток мы можем наблюдать анастаз в культивируемых клетках. Тем не менее, технически сложно наблюдать анастаз у живых животных, потому что восстановленная клетка смерти может выглядеть как нормальные здоровые клетки, которые вообще не пытались погибнуть.

Поэтому мы разработали биосенсорную систему CaspaseTracker для обнаружения и отслеживания анастаза у живых животных. Версия системы CaspaseTracker для дрозофил представляет собой двойной биосенсор, состоящий из двух компонентов: активируемого каспазой фактора транскрипции GAL4 и репортера активности GAL4, известного как G-TRACE. В клетках без активности каспаз фактор транскрипции дрожжей, GAL4, привязан к якорному домену плазматической мембраны через расщепляемый каспазой линкер DQVD.

При активации каспазы активированные каспазы расщепляют линкер DQVD, высвобождая GAL4, который затем перемещается в ядро для активации репортера G-TRACE. Ядерное ядро GAL4 связывается со специфическими восходящими активирующими последовательностями, сокращенно UAS, чтобы вызвать переходную экспрессию RFP, которая служит репортером о недавней или текущей активности каспаз до тех пор, пока каспаза и активность GAL4 не прекратятся, а белок RFP не будет деградирован. GAL4 также запускает экспрессию рекомбиназы FLP, что приводит к событию рекомбинации, которое удаляет стоп-кассету между убиквитином, сокращенно Ubi, промотером и последовательностями покрытия для GFP, нацеленной на ядерное оружие.

Это приводит к постоянной экспрессии ядерного GFP, который служит постоянным маркером для клеток, испытавших активность каспазы, но оставшихся живыми, а также для их потомства. Таким образом, эта система может идентифицировать клетки с текущей или недавней активностью каспаз по переходному сигналу RFP и с прошлой активностью каспазы с постоянным сигналом GFP. Контрольный биосенсор имеет мутацию DQVA в месте расщепления каспазы, которая нечувствительна к активности каспазы.

Чувствительных к каспазе девственных самок GAL4 скрещивали с молодыми самцами G-TRACE или наоборот для создания мух CaspaseTracker. Чтобы проверить обратимость процесса гибели клеток после активации каспаз, мухи сначала подвергаются преходящему, вызывающему гибель клеток стрессу окружающей среды, такому как холодовой шок или белковое голодание. Затем подвергшихся стрессу мух переводят обратно в нормальные условия культивирования для восстановления.

Ткани были получены из яйцевых камер в яичниках от контрольных, подвергшихся стрессу или выздоровевших мух. Образцы были подвергнуты конфокальной микроскопии для обнаружения флуоресцентных сигналов биосенсора CaspaseTracker. Для начала под наркозом, недавно закрытые каспазы-чувствительные мухи DQVD GAL4 используют углекислый газ и с помощью кисти пересаживают от 7 до 10 девственных самок во флакон со свежими продуктами с небольшой ложкой дрожжевой пасты.

Спаривание самок происходит с 7-10 молодыми самцами-репортерами G-TRACE GAL4. На только что закрытых девственных мухах виден темно-зеленый меконий, обозначенный стрелками, который является остатками пищи личинок. Недавно закрытые мухи, как правило, крупнее зрелых мух.

Самцы имеют более темное брюшко, обозначенное кругами, и, как правило, меньше самок. Установите скрещивание при температуре 18 градусов Цельсия, чтобы уменьшить неспецифические сигналы от биосенсора CaspaseTracker у потомства, потому что активность GAL4 увеличивается с температурой. Каждые три-семь дней перемещайте взрослых особей в новый флакон с дрожжевой пастой до тех пор, пока их продуктивность не снизится.

Когда потомство закрыто, соедините мух с трансгенами чувствительного к каспазе GAL4 и G-TRACE, которые будут функционировать как потомство мух CaspaseTracker. Оба вставки уравновешиваются Curly-O. Таким образом, некурчавые крылатые мухи будут иметь оба трансгена.

Для отрицательного контроля соберите двойное трансгенное потомство от скрещивания нечувствительных к каспазам самок DQVA GAL4 и самцов-репортеров G-TRACE GAL4 или наоборот. От экспериментальных скрещиваний переведите когорты от 10 до 20 недавно закрытых самок мух в новые флаконы с дрожжевой пастой. Добавление нескольких самцов поможет самкам в производстве яиц.

Перенесите сытых мух на 18 градусов Цельсия на день, чтобы их яичники произвели яйцевые камеры через ОО-генез. Затем, чтобы вызвать у своих яйцевых камер подвергнуться апоптозу, используют холодовой шок. Переложите мух в новый флакон без еды и заморозьте их при температуре 7 градусов Цельсия на час.

Альтернативным методом индуцирования апоптоза в яйцевой камере является использование белкового голодания путем размещения мух на пище с 8 процентами сахарозы и 1 процентом агара при температуре 18 градусов Цельсия в течение трех дней. При использовании этого метода ежедневно меняйте флаконы с продуктами без белка. После стресса мух любым из этих методов верните их в нормальное жилищное состояние и корм с дрожжевой пастой на три дня, чтобы они могли восстановиться.

Позже препарируйте этих мух, чтобы изолировать их яйцевые камеры и яичники. После обезболивания с помощью двух пар щипцов удалите их головки. Затем вытяните мушек у основания брюшка, чтобы удалить их яичники.

Подготовьтесь к сбору яичников, покрыв пластиковые наконечники пипеток 1 процентом BSA, растворенным в воде или PBS, чтобы яйцеклетки не прилипли к кончикам пипеток. После рассечения яйцевых камер соберите их в подготовленные наконечники примерно с половиной миллилитра PBS. Затем переложите их в центрифугу объемом один миллилитр и дайте яйцам осесть.

Продолжайте процедуру при слабом освещении или в полной темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание флуоресцентных меток. Отсадите PBS и загрузите 500 микролитров четырехпроцентного параформальдегида PBS в центрифужную пробирку. Дайте яйцам закрепиться в течение 20-30 минут при комнатной температуре с аккуратным вращением.

Избегайте длительной фиксации, так как она истощит сигнал флуоресцентных белков в яичных камерах. После фиксации удалите PFA и промойте яйцевые камеры 500 микролитрами PBS-T три раза. Затем инкубируйте яйцевые камеры с PBS-T в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия с легким вращением, чтобы пропитать яйцевые камеры.

На следующее утро добавьте в яйцевые камеры 500 микролитров PBS-T с 5 микрограммами синего ядерного красителя, такого как Hoechst. Дайте им высиживаться при осторожном вращении при комнатной температуре в течение одного-двух часов, но не дольше, иначе сигналы станут неспецифическими. Далее промойте яйцевую камеру PBS-T три раза по 10 минут за одну промывку.

Затем с помощью тонкой пипетки отсадите все PBS-T и нанесите 200 микролитров антиотбеливающего монтажного средства. Ткани плавают на поверхности до того, как полностью впитают монтажное вещество. Инкубируйте яйцевую камеру в средстве при температуре 4 градуса Цельсия от трех часов до ночи.

После полного впитывания монтажного агента ткани опускаются на дно трубок и готовы к монтажу. Для начала нанесите вазелин на предметное стекло или защитный листок, чтобы избежать разрушения яйцевых камер из-за чрезмерного сжатия. Чтобы смонтировать камеры с окрашенными яйцами, перенесите их с 200 микролитрами монтажного агента на предметное стекло и накройте стеклянной крышкой площадью 20 квадратных миллиметров.

Заклейте покровное стекло лаком для ногтей и приступайте к использованию конфокальной микроскопии. В яйцевых камерах яичников у здоровых мух CaspaseTracker отсутствовала активность биосенсора CaspaseTracker, о чем свидетельствовало отсутствие зеленой и красной флуоресценции. Однако, после того, как мухи подвергались стрессу окружающей среды, вызывающему гибель клеток, такому как белковое голодание в течение трех дней, в яйцевых камерах происходил процесс клеточной смерти с активацией каспаз, которая индуцировала сигналы биосенсоров RFP и GFP.

Напротив, мутация сайта расщепления каспаз в контрольной группе DQVA, нечувствительной к каспазам, снижает чувствительность биосенсора, что указывает на то, что сигналы биосенсора зависят от активности каспаз. Затем голодающим, чувствительным к каспазам биосенсорным мухам давали белковую пищу в течение трех дней. Яйцевые камеры выздоровевших мух не экспрессировали RFP transient caspase reporter, что указывает на отсутствие недавней или продолжающейся активности каспазы.

Важно отметить, что восстановленные яйцевые камеры экспрессировали только GFP, что указывает на то, что они обратили вспять процесс гибели клеток после активации каспазы. Анастаз также наблюдается in vivo после транзиторного температурного стресса, вызывающего гибель клеток. В ответ на холодовой шок камеры умирающих яиц экспрессируют биосенсорные маркеры RFP и GFP, указывающие на недавнюю или текущую активность каспаз, представленную сигналом RFP, и прошлую активность каспазы, представленную сигналом GFP.

Тем не менее, после снятия стресса путем возвращения к нормальному культуральному состоянию в течение трех дней, в яйцевых камерах у выздоровевших мух наблюдался только репортер GFP-каспазы, что указывает на то, что клетки в этих яйцевых камерах подверглись анастазу в момент после активации каспазы. Примечательно, что сигнал GFP CaspaseTracker показывает, что несколько типов клеток в яйцевых камерах способны обратить вспять процесс гибели клеток и восстановить повреждения от каспаз, включая клетки зародышевой линии, такие как ооциты и клетки-медсестры, а также клетки соматических фолликулов. Интересно, что GFP также мечет клетки в гермарии, которые содержат стволовые клетки, а также связанные с ним яйцевые камеры в той же яичниковой цепи.

Таким образом, эти GFP-положительные яйцевые камеры могли быть получены из стволовых клеток, подвергшихся анастазу. Вот изображения, показывающие ткани, которые проявляют активность биосенсора CaspaseTracker без воздействия стресса окружающей среды. Это ротовые части, передняя кишка, полях, средняя кишка, задняя кишка, мальпигиевые канальцы, анус, яйцевод и яичники рассеченной, только что закрытой самки мухи Дня 0.

Конфокальная микроскопия выявляет недавнюю активность каспаз, на которую указывает RFP, и прошлую активность каспазы, на которую указывает GFP. Увеличенные изображения показывают недавнюю или текущую и прошлую активность каспаз в зрительной доле, кардии, мальпигиевых канальцах, задней кишке и мышечных стенках на яйцевых камерах, которая была локализована с окрашиванием F-актином. Некоторые ткани, такие как яйцевод, демонстрируют только прошлую активность каспаз.

Эти биосенсорные активности предполагают потенциальную анестезиологическую активность во время эмбрионального развития или нормального гомеостаза. Это также может указывать на текущую или прошлую активность неапоптотических каспаз. Пожалуйста, ознакомьтесь с рукописью для получения более подробной информации.

Биосенсор in vivo CaspaseTracker конкретно сообщает об активности каспазы, поскольку нечувствительный CaspaseTracker с последовательностью, не поддающейся расщеплению каспазы, DQVA не обладает биосенсорной активностью. Единственным сигналом здесь является неспецифический сигнал автофлуоресценции от пигментов, кутикулы и жировых тел. После просмотра этого видео у вас должно сложиться общее представление о том, как мы можем использовать биосенсорную систему CaspaseTracker для обнаружения и отслеживания анастаза у живых животных.

Эти биосенсоры могут облегчить изучение валюты и известной функции анастаза. Их определение досягаемости имеет широкий спектр физиологических, патологических и терапевтических применений. В то время как эти биосенсоры могут обнаруживать обратное развитие апоптоза после активации каспаз, они также могут обнаруживать восстановление клеток после того, как они пытаются осуществить другие формы клеточной гибели, которые прямо или косвенно связаны с активностью каспазы.

При планировании эксперимента очень важно включить реципрокный контроль, чтобы отличить сигнал флуоресцентного биосенсора, который отслеживает анестетические клетки, от умирающих клеток с продолжающейся активностью каспаз. Здоровые клетки с текущей или прошлой известной активностью апоптотических каспаз и неспецифическим аутофлуоресцентным сигналом от пигмента, жира и критических клеток. Пожалуйста, найдите подробное обсуждение в PDF-версии этой рукописи.