Протокол для функциональной оценки цельного белка Насыщенность мутагенеза библиотек Использование высокого секвенирования

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы описать функциональную оценку комплексных библиотек мутагенеза белков с одним сайтом с использованием высокопроизводительного секвенирования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биохимии и молекулярной эволюции. Например, каковы биохимические, структурные и эволюционные ограничения белков?

И как мы можем создать белки с новыми функциями? Основное преимущество этого метода заключается в том, что он максимизирует количество полезных операций секвенирования в исследовании мутагенеза с насыщением цельного белка за счет многоуровневого построения библиотеки и секвенирования. После подготовки планшета PCR Master Mix в соответствии с текстовым протоколом с помощью многоканальной пипетки переведите 10 микролитров из 96-луночных планшетов, содержащих ранее разбавленные праймеры мутагенеза Sense, в родственные лунки в ПЦР-планшетах.

Используйте пломбировку, чтобы покрыть каждую ПЦР-пластину, и центрифугируйте при давлении 200 G в течение двух минут. Затем перенесите ПЦР-планшеты в термоамплификатор и запустите следующую программу. После проведения дополнительной ПЦР и разбавления реакций, от одного до 100, переведите один микролитр из смешанных и разбавленных мутагенных продуктов ПЦР первого раунда в родственные лунки новых ПЦР-планшетов, содержащих Master Mix.

Используйте пломбу планшета, чтобы закрыть каждую ПЦР-пластину. Центрифугируйте планшеты при давлении около 200 G в течение двух минут. Затем перенесите пластины в термоамплификатор, и запустите ту же программу, которая указана ранее в видео.

После проверки размеров ПЦР-продукта и измерения концентраций в соответствии с текстовым протоколом смешайте 100 нанограммов каждого суббиблиотечного ПЦР-продукта NNS в пять подбибиотечных групп NNS. После запуска реакций суббиблиотечной ПЦР и расщепления векторов клонирования в реакциях ПЦР, в соответствии с текстовым протоколом, настройте реакции лигирования в соответствии с этими рекомендациями для каждой группы суббиблиотеки NNS с родственным ей вектором клонирования рестрикции. Затем выдерживайте при комнатной температуре в течение одного часа.

После того, как электрокомпетентные клетки E.coli будут разморожены, добавьте десять микролитров клеток в каждую очищенную реакцию лигирования и перенесите в электропрорационную кювету. Электропропорционально распределите ячейки при напряжении 1,8 киловольта, затем добавьте один миллилитр среды SOB и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем повторно суспендируйте 10 микролитров каждой восстановительной культуры в 990 микролитрах LB. И распределите 100 микролитров на шнековые пластины LB, содержащие 12 микрограмм на миллилитр тетрациклина.

Для каждой восстановительной культуры приготовьте 250-миллилитровую культуральную колбу с 50 миллилитрами фунта и 50 микролитрами тет-бульона. Переложите оставшийся примерно один миллилитр восстановительной культуры в колбу. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин в течение ночи.

Подсчитав количество успешных трансформантов на пластинах и выделив плазменную ДНК из ночных культур, смешайте 100 нанограммов каждой плазмиды. После преобразования библиотеки ДНК в соответствии с текстовым протоколом, разбавьте ночную культуру библиотеки до OD-600, равного 0,1. И добавьте один миллилитр в одну колбу.

Инкубируйте культуру предварительного отбора при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин. Периодически контролируйте рост, измеряя OD-600, пока он не станет равным 0,1. Перелейте 100 миллилитров предварительно отобранной культуры в две 50-миллилитровые конические пробирки и центрифугируйте при 4000 G в течение шести минут, при четырех градусах Цельсия.

Удалите большую часть надосадочной жидкости и соедините гранулы в одну коническую трубку объемом 15 миллилитров. Затем, повторив центрифугирование, удалите всю надосадочную жидкость. В две другие колбы добавьте тетрациклин до конечной концентрации 12 микрограмм на миллилитр.

И объем культуры предварительного отбора, такой, что итоговый OD-600 равен 0,001. В одну колбу добавьте в один миллилитр 50 мг на миллилитр ампициллина в конечной концентрации 50 мкг на миллилитр. Это и есть культура отбора.

При инкубации культур при температуре 37 градусов Цельсия при 200 об/мин следите за ростом культуры, не содержащей ампициллина, до тех пор, пока она не достигнет OD-600, равного 0,1. Также измерьте OD-600 селекционной культуры. Разделив OD-600 селекционной культуры на 0,1 и умножив на 100, перенесите этот объем в 50-миллилитровые конические пробирки, и центрифугируйте при 4000 G и четырех градусах Цельсия в течение шести минут.

После удаления большей части надосадочной жидкости объедините гранулы в одну пробирку, прежде чем снова вращать и удалять всю надосадочную жидкость. Чтобы провести высокопроизводительное секвенирование, приготовьте PCR Master Mix и перенесите 23 микролитра в 10 ПЦР-пробирок. Добавьте один микролитр 0,5 нанограмма на микролитр очищенной плазмидной ДНК из культуры предварительного отбора в пробирки с первой по пятую.

А от селекционной культуры до пробирок с шестой по 10. Смешайте 50 микролитров 50 микромолярных прямо-ортогональных праймеров, от OP1F до OP5F, с соответствующими обратно-ортогональными праймерами, от OP1R до OP5R. В том же порядке переложите по одному микролитру в ПЦР-пробирки с первого по пятый, и с шестого по 10.

Перенесите пробирки для ПЦР в термоамплификатор и запустите следующую программу. Затем разбавьте ПЦР-реакции в 100 раз, переложив по одному микролитру из каждой пробирки на 99 микролитров воды. Хорошо перемешайте, затем наберите пипеткой 99 микролитров из пробирок, и выбросьте.

Смешайте 50 микролитров прямого и соответствующего обратного грунтовок. Затем переложите по одному микролитру в ПЦР-пробирки от одного до пяти, и от шести до 10. Затем, после приготовления PCR Master Mix, добавьте по 23 микролитра в каждую ПЦР-пробирку, и запустите следующую программу.

Для проведения финальных ПЦР с добавлением индексирующих последовательностей, предварительно разбавив ПЦР-реакции в 100 раз, как и раньше, и оставив один микролитр, добавить 23 микролитра PCR Master Mix. Для трубок с матрицей, происходящей из групп подбиблиотеки NNS с первой по пятую, добавьте 0,5 микролитра прямых праймеров от 501F до 505F соответственно. Для пробирок с матрицей, полученной в результате предварительного отбора и отбора культур, добавляют 0,5 мкл обратных праймеров 701R и 702R.

Запустите ту же программу ПЦР, как только что указано. Затем, после измерения концентраций каждой реакции согласно текстовому протоколу, смешайте по 100 нанограммов каждого продукта ПЦР в одной микроцентрифужной пробирке. После добавления 6-кратного гелевого красителя загрузите весь объединенный образец ПЦР в двухпроцентный агарозный гель.

И запустите гель при напряжении 100 вольт, в течение 50 минут. С помощью длинноволнового УФ-осветителя визуализировать, а затем вырезать срез, содержащий продукт ПЦР примерно из 360 пар оснований. Очистите, секвенируйте и проанализируйте образец в соответствии с текстовым протоколом.

Здесь показана плазмидная карта пяти модифицированных плазмид pBR322, содержащих ортогональные сайты прайминга. Тестирование на специфичность ортогональных праймеров с помощью ПЦР показало, что правильный продукт ПЦР был получен только при включении в реакцию подходящей плазмиды. И никакого продукта какого-либо размера при его отсутствии не получалось.

После обработки эксперимента было получено 6,2 умножить на 10 на шестое из условия предварительного отбора и 6,3 раза на 10 на шестое из условия ампициллина. Подсчеты для каждой аминокислотной мутации из условия предварительного отбора показывают логнормальное распределение. На этом рисунке показан эффект относительной приспособленности, FIA, для каждой мутации в каждой позиции TEM-one.

А его распределение показано здесь. При отборе в концентрации 50 микрограммов на миллилитр ампициллина большинство мутаций имеют нейтральный или почти нейтральный эффект приспособленности. Соответствует белым пикселям здесь, и большому пику здесь.

Небольшая часть мутаций при такой концентрации антибиотика оказывает существенное влияние на физическую форму. Как и ожидалось, к ним относятся мутации в высококонсервативных остатках активного центра. В отличие от этого, некоторые пиксели кажутся столь же заметно красными.

После освоения этой техники ее можно сделать примерно за неделю. Если она выполнена правильно, и все реактивы в наличии. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости оставаться организованным во время клонирования, чтобы объединить мутагенные продукты ПЦР в правильные группы и клонировать в правильные векторы.

А во время подготовки к секвенированию, использовать правильные праймеры. Исходя из этой процедуры, основные этапы протокола могут быть модифицированы для изучения комбинаций мутаций, различных сред отбора и других белковых систем, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся генетической и экологической зависимости мутаций от контекста. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о работе, необходимой для создания библиотеки мутагенеза с насыщением всего белка и для одновременной оценки функциональных эффектов каждой мутации с использованием высокопроизводительного секвенирования.

Не забывайте, что работа с бромидом этидия и ультрафиолетовым излучением может быть опасной, поэтому при выполнении части этого протокола всегда следует соблюдать такие меры предосторожности, как перчатки, лабораторный халат и защита от ультрафиолета.