Синтез Длина волны сдвига ДНК гибридизационных зондов с помощью фотостабильным цианиновыми Красители

Общая цель этого эксперимента — визуализировать перенос энергии от одной модифицированной нити ДНК красителя к другой. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области молекулярной биологии. Например, интерференция РНК путем мониторинга процессинга и целостности миРНК в живых клетках в режиме реального времени.

Основным преимуществом данной методики, является легкость контроля за охватом соцветий и изменением цвета, что дает четкий результат. Таким образом, ложноположительные результаты исключаются. Для начала этой процедуры добавьте соответствующие реактивы, как указано в текстовом протоколе, в 20-миллилитровую круглодонную колбу, оснащенную магнитной мешалкой и дефлегматором.

Затем добавьте ноль целых ноль целых шесть миллилитров пиперидина. И нагреваем реакционную смесь до 80 градусов Цельсия в течение четырех часов. После того как реакция остынет до комнатной температуры, соберите образовавшийся осадок методом фильтрации.

И трижды умываемся диэтиловым эфиром. Далее добавьте в надосадочную жидкость сто миллилитров диэтилового эфира. И собрать образовавшийся осадок методом фильтрации.

После трехкратной промывки с диэтиловым эфиром соедините осадок с выделенным твердым веществом от первой фильтрации. С помощью компьютера, подключенного к синтезатору ДНК, введите нужную последовательность ДНК и метод сопряжения. Следуя подсказкам из протокола производителя.

Далее в синтезатор монтируется колонка с контролируемым литым стеклом, модифицированным одним микромолем первой грани. Теперь приступаем к синтезу на синтезаторе ДНК. После обработки нитей ДНК добавьте соответствующие регенты, как указано в текстовом протоколе, в диэтилизированный алкин, модифицированный образец ДНК.

Инкубируйте образец при температуре 60 градусов Цельсия в течение одного пункта в течение пяти часов. Затем переложите образец в пробирку объемом 10 миллилитров. После охлаждения до комнатной температуры добавьте в образец ДНК 150 микролитров раствора динатриевой соли ЭДТА нулевой целых ноль целых ноль целых ноль целых пять десятых и 450 микролитров раствора ацетата натрия нулевого целых три целых три десятых.

После этого добавьте в пробу 10 миллилитров этанола. И держать его при температуре минус 32 градуса по Цельсию в течение 16 часов. Затем центрифугируйте образец в течение 15 минут при температуре, умноженной на тысячу G. Когда закончите, удалите надосадочную жидкость.

Полученную ДНК-гранулу промойте двумя миллилитрами холодного 80%-ного этанола. Затем высушите пеллеты при пониженном давлении с помощью сублимационной сушилки. Очистите сырую гранулу ДНК с помощью HP LC.Контролируйте прогон, проверяя 260 нанометров и 459 нанометров для красителя.

Или 542 нанометра для красителя два. Соберите дроби, которые показывают поглощение в обоих каналах длины волны. Для измерений с помощью одноцепочечной абсорбционной спектроскопии запишите холостое измерение, содержащее только 200 миллимоляров хлорида натрия и 50 миллимолярных буферов фосфата натрия.

Далее переложите приготовленный ранее раствор DNA1 в кювету из кварцевого стекла толщиной в один сантиметр. Запишите поглощение. Затем определяют максимальное значение поглощения красителя.

Для измерений с помощью одноцепочечной флуоресцентной спектроскопии запишите заготовку, содержащую только 200 миллимоляров хлорида натрия и 50 миллимоляров фосфата натрия, используя длину волны возбуждения по красителю. После этого поместите кювету с раствором DNA1 в спектрометр. Запишите спектр цветения.

Для проведения двухцепочечного флуоресцентного спектроскопии необходимо поместить кювету с двухцепочечным раствором ДНК1 и ДНК2 в спектрометр. Затем зарегистрируйте флуоресцентный спектр, используя длину волны возбуждения по красителю. Чтобы лучше понять, что показывают записанные спектры, облучайте кюветы ручными ультрафиолетовыми лампами.

Наблюдайте за изменением цвета цветения от одноцепочечной к двухцепочечной ДНК. Зарегистрированные спектры поглощения показывают максимумы на 465 нм для одноцепочечной ДНК1 и 546 нм для одноцепочечной ДНК2. Отожженная двойная цепь ДНК1 и ДНК2 показывает максимумы как на 469, так и на 567 нанометрах.

Оба максимума поглощения демонстрируют батаохромный сдвиг. А мельчайшие спектроскопические изменения являются результатом экситонных взаимодействий между красителями в архитектуре двойной спирали ДНК. Соответствующие флуоресцентные спектры демонстрируют максимумы на 537 нанометрах для одноцепочечной ДНК1.

На 607 нанометрах для одноцепочечной ДНК2. И на 615 нанометрах для отожженных, двухцепочечных ДНК1 и ДНК2. Двухцепочечный ДНК1 и ДНК2, показывает только максимум излучения второго красителя, хотя первый краситель избирательно возбуждается, что свидетельствует о том, что передача энергии происходит эффективно от первого красителя к красителю два.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как провести синтетическую модификацию ДНК с помощью парной каталитической реакции алкиновой меченой нити ДНК с А-стороной.