Синтез Длина волны сдвига ДНК гибридизационных зондов с помощью фотостабильным цианиновыми Красители

Общая цель данного эксперимента — визуализировать перенос энергии от одной модифицированной красителем нити ДНК к другой. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области молекулярной биологии, таких как РНК-интерференция, путем мониторинга процессинга и целостности siRNA в живых клетках в режиме реального времени.

Основным преимуществом данного метода является простота мониторинга распространения флуоресценции и изменения цвета, что позволяет получить четкий результат. Таким образом, исключаются ложноположительные результаты. Для начала процедуры добавьте соответствующие реагенты, указанные в текстовом протоколе, в круглодонную колбу объемом 20 мл, оснащенную магнитной мешалкой и обратным холодильником.

Затем добавьте 0,06 мл пиперидина. Нагрейте реакционную смесь до 80 °C и выдержите в течение четырех часов. После охлаждения смеси до комнатной температуры соберите выпавший осадок путем фильтрации.

Трижды промойте диэтиловым эфиром. Затем добавьте сто миллилитров диэтилового эфира к супернатанту. Собертите выпавший осадок путем фильтрации.

После трехкратного промывания диэтиловым эфиром объедините осадок с твердым веществом, выделенным при первой фильтрации. С помощью компьютера, подключенного к синтезатору ДНК, введите необходимую последовательность ДНК и метод сшивки, следуя указаниям протокола производителя.

Затем установите в синтезатор колонку с контролируемым стеклом для перелива, модифицированным одним микромолем первой фазы. Теперь запустите синтез на ДНК-синтезаторе. После обработки нитей ДНК добавьте соответствующие реагенты, указанные в текстовом протоколе, в образец модифицированной ДНК с диэтилированным алкином.

Инкубируйте образец при 60 °C в течение 1,5 часов. Затем перенесите образец в пробирку объемом 10 мл. После охлаждения до комнатной температуры добавьте к образцу ДНК 150 µL 0,05 M раствора динатриевой соли ЭДТА и 450 µL 0,3 M раствора ацетата натрия.

После этого добавьте к образцу 10 milliliters этанола. Выдержите его при температуре -32 °C в течение 16 часов. Затем центрифугируйте образец в течение 15 минут при 1000 ×g. По завершении удалите супернатант.

Промойте полученный осадок ДНК двумя миллилитрами холодного 80% ethanol. Затем высушите осадок под вакуумом, используя лиофилизатор. Очистите неочищенный осадок ДНК методом HP LC. Контролируйте ход разделения, отслеживая поглощение при 260 нанометрах и 459 нанометрах для Dye one.

Или 542 нанометров для красителя два. Соберите фракции, демонстрирующие абсорбцию в обоих каналах длины волны. Для спектроскопических измерений абсорбции одноцепочечных молекул зарегистрируйте холостой замер, содержащий только 200 миллимолярный раствор хлорида натрия и 50 миллимолярный натрий-фосфатный буфер.

Затем перенесите ранее приготовленный раствор DNA1 в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см. Запишите значение абсорбции. Затем определите максимальное значение абсорбции красителя.

Для проведения одноцепочечной флуоресцентной спектроскопии зарегистрируйте холостой опыт, содержащий только 200 millimolar хлорида натрия и 50 millimolar фосфата натрия, используя длину волны возбуждения Dye one. После этого поместите кювету с раствором DNA1 в спектрометр. Зарегистрируйте спектр флуоресценции.

Для проведения измерения флуоресцентной спектроскопии двухцепочечной ДНК поместите кювету с раствором двухцепочечной ДНК1 и ДНК2 в спектрометр. Затем запишите флуоресцентный спектр, используя длину волны возбуждения Красителя 1. Чтобы лучше понять результаты записанных спектров, облучите кюветы ручными УФ-лампами.

Понаблюдайте за изменением цвета флуоресценции при переходе от одноцепочечной к двухцепочечной ДНК. Зарегистрированные спектры поглощения показывают максимумы на 465 нанометрах для одноцепочечной ДНК1 и на 546 нанометрах для одноцепочечной ДНК2. Отжёженная двухцепочечная ДНК, состоящая из ДНК1 и ДНК2, демонстрирует максимумы как на 469, так и на 567 нанометрах.

Оба максимума поглощения демонстрируют батохромный сдвиг. Наименьшие спектроскопические изменения являются результатом экситонных взаимодействий между красителями внутри двойной спирали ДНК. Соответствующие флуоресцентные спектры демонстрируют максимумы при 537 нанометрах для одноцепочечной ДНК1.

На 607 нанометрах для одноцепочечной ДНК2. И на 615 нанометрах для отжёженной двухцепочечной ДНК1 и ДНК2. Двуцепочечная ДНК1 и ДНК2 демонстрируют исключительно максимум эмиссии Красителя 2, несмотря на селективное возбуждение Красителя 1, что свидетельствует об эффективности переноса энергии от Красителя 1 к Красителю 2.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить постсинтетическую модификацию ДНК с помощью нескольких каталитических реакций олигонуклеотидной цепи ДНК, меченной алкином, с А-стороной.