Предотвращение теплового стресса побочные эффекты у крыс Сенная палочка Штамм

Мы описали протокол предотвращения эффектов теплового стресса у крыс путем предварительной обработки полости рта полезными бактериями. Этот протокол может быть модифицирован и использован для различных путей введения и для анализа различных соединений.

Общая цель данного эксперимента — оценить профилактический эффект штамма B.subtilis BSB3 против осложнений после теплового стресса. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в профилактике неблагоприятных последствий теплового стресса. Основное преимущество этого метода заключается в том, что его можно использовать для оценки различных подходов к смягчению осложнений теплового стресса.

Демонстрировать эту процедуру будет Людмила Глоба. И Олег Пусовый, научные сотрудники нашей лаборатории. Для начала с одной колонии Bacillus subtilis BSB3, которая была выращена за ночь на питательной агаровой пластине.

Заквашите десять миллилитров питательного отвара в колбу. Выращивают культуру за ночь при 37 градусах Цельсия. Приготовьте 500 миллилитров среды для спороношения в соответствии с приведенным здесь рецептом.

И автоклав при 121 градусе Цельсия в течение 20 минут. Дайте среде остыть до 50 градусов Цельсия перед добавлением следующих стерильных растворов. В стерильном шкафу охладите подготовленную среду при комнатной температуре до 40 градусов Цельсия в течение 20 минут.

И налить по 25 миллилитров в каждую из 20 стерильных чашек Петри. Дайте среде застыть в течение ночи. Далее разложите 0,5 миллилитра ночной культуры Bacillus subtilis BSB3 на поверхность пластин среды для спороношения.

Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти дней до 90% спороношения. Затем используйте микроскопию высокого разрешения, чтобы проверить наличие фазовых спор. Чтобы собрать бактерии, добавьте один миллилитр PBS в тарелки и используйте стерильный распределитель клеток, чтобы соскоблить бактерии с поверхности.

Храните суспензию при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока она не понадобится. Подтвердите жизнеспособность бактерий путем нанесения 0,1 миллилитра соответствующего разведения бактериальной суспензии на планшеты со споруляционной средой и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18-24 часов. Используйте счетчик колоний колоний для подсчета колоний бактерий и расчета титра бактерий в тестируемой суспензии.

Затем приготовьте бактериальную суспензию в PBS в конечной концентрации от одного умножить на десять-восьмую КОЕ на миллилитр. После обработки крыс пероральным зондированием B.subtilis BSB3 или PBS в течение двух дней, затем разделения животных и измерения их температуры, содержание крыс из первой и второй групп при комнатной температуре в течение 25 минут. Поместите животных третьей и четвертой групп в климатическую камеру при температуре 45 градусов Цельсия и относительной влажности 55% на 25 минут.

После повторного измерения ректальной температуры каждой крысы поместите всех животных при комнатной температуре на четыре часа. Затем, после усыпления животных, сбора крови из туловища и выделения органов в соответствии с текстовым протоколом, поместите каждый образец органа в предварительно взвешенные стерильные пробирки и взвесьте. Добавьте стерильный PBS в каждую пробирку, чтобы получить разведение образца от одного до десяти весов на объем, и используйте гомогенизатор тканей из стерильного стекла для получения однородных тканевых суспензий.

Затем используйте стерильный PBS для последовательного разведения каждого образца. Затем нанесите 0,1 миллилитра всех разведений на поверхность Мак-Конки и 5% кровяного агара. И бруцелла кровяной агар с гемином и витамином К1. После инкубации пластин используйте счетчик колоний, чтобы подсчитать колонии на каждой группе пластин.

Выразите результаты в виде количества колониеобразующих единиц, или КОЕ, на грамм ткани. После подготовки и окрашивания срезов тонкого кишечника в соответствии с текстовым протоколом с помощью микроскопа высокого разрешения измерьте кишечные ворсинки и общую толщину стенки слизистой оболочки. Проанализируйте не менее четырех образцов от каждой крысы и проведите не менее 20 измерений в каждом образце.

Для проведения световой микроскопии образцов крови с высоким разрешением используйте виброизоляционную платформу в качестве базы для микроскопической системы с видеокамерой и компьютером для записи изображений в реальном времени. После калибровки тестовых изображений в соответствии с текстовым протоколом поместите на предметное стекло семь микролитров свежевзятой крови от каждой крысы и добавьте покровный листок. Затем сфотографируйте и запишите десять кадров изображения размером 72 на 53,3 микрометра в квадрате в каждом образце.

Наконец, с помощью программного обеспечения, которое обеспечивает прямой просмотр оптических изображений с высоким разрешением в режиме реального времени, измерьте концентрацию везикул. Средняя температура тела животных до и сразу после теплового стресса составила 36,7 плюс-минус 07 градусов Цельсия и 40,3 плюс-минус 0,17 градусов Цельсия соответственно. Воздействие тепла на крыс приводило к значительному угнетению высоты ворсинок и общей толщины слизистой оболочки.

Однако лечение штаммом BSB3 перед стрессом, защитило кишечник от вредного воздействия тепла. На предмет транслокации бактерий из кишечника анализировали брыжеечные лимфатические узлы, печень и селезенку. Как показано на рисунке, бактерии были выделены в концентрации от 1,7 до 10 до 3 плюс-минус 4,6 умножить на 10 на 2 КОЕ на грамм ткани только в образцах из брыжеечных лимфатических узлов и печени крыс, получавших PBS, подвергшихся воздействию тепла.

С другой стороны, все протестированные образцы от контрольных и подвергшихся тепловому стрессу животных, получавших штамм BSB3, были стерильными. У крыс, подвергшихся тепловому стрессу, не было зарегистрировано никаких изменений в уровнях IL 1beta, IL-6, TNFalpha или цитокинов интерферона гамма. Тем не менее, уровни IL-10 и LPS были повышены у животных, получавших PBS до термической обработки.

Таким образом, предварительная обработка B.subtilis BSB3 предотвращала повышение уровня IL-10 и ЛПС в сыворотке крови после термической обработки. Наконец, значительное увеличение концентрации свободных пузырьков было обнаружено в крови крыс, получавших PBS до теплового стресса, но не у животных, получавших BSB3. Важно помнить о необходимости использования пирогенных материалов для забора крови и точности поддерживать температуру жидкостей сыворотки при температуре минус 20 градусов Цельсия при многократном замораживании и размораживании, а также соблюдать стерильную процедуру во время анализа на бактериальную транслокацию.

Следуя этой процедуре, можно провести введение бактерий после теплового стресса, чтобы ответить на дополнительные вопросы об осложнениях теплового стресса.